双甲脒杀螨活性靶标基因初步筛选

作     者：张圆圆 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张永强;徐志峰

授予年度：2022年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：朱砂叶螨 双甲脒 章鱼胺受体 真核表达 分子对接 

摘      要：双甲脒(Amitraz)是一种广谱性甲脒类杀虫杀螨剂,对叶螨科各个发育阶段的螨态均有良好的防控效果,长期用于防治果树、蔬菜、茶叶、棉花、大豆、甜菜等作物上的害虫害螨,前期研究通过体外生理学实验发现双甲脒作用于无脊椎动物的章鱼胺受体。朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)中存在多种类型的章鱼胺受体,各自参与的下游信号通路也有所不同,但具体哪一种章鱼胺受体是双甲脒的主要作用靶标并没有相关研究。因此,本论文以一种重要农业害螨朱砂叶螨为研究对象,克隆并筛选章鱼胺受体基因,通过分析其分子生物学特性和药理学性质,进行双甲脒敏感性检测和靶标结合位点预测,鉴定了双甲脒在朱砂叶螨体内的具体作用靶标。主要研究结果如下:1.朱砂叶螨章鱼胺受体基因Tc Octβ2R和Tc Tyr1R的克隆及序列分析通过分析和筛选朱砂叶螨转录组数据库和二斑叶螨基因组库,成功克隆获得朱砂叶螨章鱼胺受体基因Tc Octβ2R和Tc Tyr1R的c DNA全长序列。通过TMHMM软件预测发现,2条基因编码的氨基酸序列都具有7个疏水线性α-螺旋跨膜结构,属于典型的G蛋白偶联受体(guanine nucleotide-binding regulatory protein-coupled receptors,GPCRs)家族成员。与其他蜱、昆虫、螨的章鱼胺受体的多重序列比对结果显示这2条基因序列均具有相似的同源保守区域;通过与鞘翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、直翅目和膜翅目昆虫以及蛛形纲其他物种的章鱼胺受体进行系统发育分析,结果显示Tc Octβ2R和Tc Tyr1R分别与其他物种的Octβ2Rs和Tyr1Rs受体聚在一起,同源性较高,亲缘关系较近,证明Tc Octβ2R和Tc Tyr1R分别属于β2-adrenergic-like和OA/tyramine 1章鱼胺受体。2.双甲脒对朱砂叶螨的毒力测定及胁迫表达分析双甲脒对朱砂叶螨的毒力测定结果表明,双甲脒对朱砂叶螨的毒力效果较好,致死中浓度(lethal concentration 50%,LC)为25.02 mg/L。通过实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative-Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)技术检测亚致死剂量的双甲脒胁迫处理朱砂叶螨后章鱼胺受体基因转录水平的变化,结果显示,仅Tc Octβ2R基因出现差异下调表达,且下调反应随双甲脒浓度升高而增强,推测该基因可能是双甲脒的靶标基因。而Tc Tyr1R基因在处理组和对照组之间并未出现差异表达,说明该基因对双甲脒并不敏感,推测其不是双甲脒的作用靶标。3.朱砂叶螨Tc Octβ2R和Tc Tyr1R基因功能鉴定和对双甲脒的敏感性检测利用pc DNA3.1(+)质粒构建目的基因重组表达载体,在哺乳动物细胞中表达,章鱼胺受体的模式配体章鱼胺和酪胺均能够有效地激活Tc Octβ2R和Tc Tyr1R,并且其激活能力呈现出浓度依赖性,说明Tc Octβ2R和Tc Tyr1R均在HEK-293细胞和CHO细胞中实现了功能性表达。随后进行了章鱼胺受体对双甲脒的敏感性检测,双甲脒对Tc Octβ2R的激动能力大约是Tc Tyr1R的24倍(半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC):Tc Octβ2R(8.59×10M)Tc Tyr1R(2.07×10M)),这表明相比于Tyr1型章鱼胺受体,双甲脒能够更好地激活朱砂叶螨Octβ2型章鱼胺受体,证明Octβ2型章鱼胺受体Tc Octβ2R可能是双甲脒主要的靶标基因。4.朱砂叶螨章鱼胺受体Tc Octβ2R和Tc Tyr1R与配体的结合位点分析将朱砂叶螨Tc Octβ2R和Tc Tyr1R构建三维结构模型,显示其具有7个α-螺旋结构,属于典型的GPCR结构。分子对接结果显示,Tc Octβ2R与双甲脒有着比其天然配体章鱼胺更好的结合模式,而Tc Tyr1R与双甲脒的结合强度弱于其天然配体,且双甲脒与Tc Octβ2R的结合强度高于Tc Tyr1R,进一步验证了Tc Octβ2R是双甲脒对朱砂叶螨的主要靶标基因;双甲脒通过氢键作用力与Tc Octβ2R三维结构模型上109位的天冬氨酸(Asp)结合,自由结合能为-6.90 Kcal/mol。章鱼胺受体的天然配体章鱼胺也在Asp109处形成了氢键,两者可能存在竞争结合。朱砂叶螨Tc Octβ2R与其他节肢动物多序列比对的结果,发现多物种在109位处的氨基酸残基都为天冬氨酸(D),推测Asp109是双甲脒作用于Tc Octβ2R的关键氨基酸位点。综上所述,本研究成功克隆并鉴定朱砂叶螨2条章鱼胺受体基因Tc Octβ2R和Tc Tyr1R,进而分析了双甲脒对朱砂叶螨的毒力效果、靶标基因和结合位点,证明了Tc Octβ2R是双甲脒对朱砂叶螨的靶标基因,Asp109是其作用位点。研究结果将丰富对朱砂叶螨章鱼胺受体生理功能和结构的认识,为构建章鱼胺受体激动剂和拮抗剂筛选平台奠定基础,对设计和开发以章鱼胺受体为靶标的新型杀螨剂具有重要的指导意义。