褪黑素通过调控卵巢巨噬细胞的极化激活生殖干细胞功能的研究

作     者：邓佩 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑月慧

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：褪黑素 卵巢生殖干细胞 巨噬细胞 缺氧 炎症 

摘      要：目的探讨褪黑素(Melatonin,MT)通过调控卵巢巨噬细胞的极化在激活内源性卵巢生殖干细胞(Ovarian germinal stem cells,OGSCs)中的作用。研究方法使用氯化钴(CoCl)刺激诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞缺氧,建立体外巨噬细胞缺氧模型,同时,探索缺氧环境下巨噬细胞Mφ极化状态。进而探索MT对巨噬细胞Mφ缺氧改善和极化状态调节作用;通过卵巢巨噬细胞共培养,探索MT对激活小鼠OGSCs功能的作用。1.筛选CoCl致RAW264.7巨噬细胞缺氧模型的适宜浓度和作用时间。巨噬细胞RAW264.7孵育CoCl培养,将RAW264.7巨噬细胞随机分为空白对照(Control)组、50μM CoCl组、100μM CoCl组、150μM CoCl组四组,同步Western blot检测缺氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-lα,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的蛋白水平的变化,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α),一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒测定NO的含量的变化。确定缺氧造模实验CoCl孵育最佳时间,RAW264.7巨噬细胞孵育CoCl过程中,通过Western blot检测HIF-1α、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和磷酸化NF-κB(Phospho-NF-κB,p-NF-κB)蛋白表达量的变化,确定CoCl孵育最佳时间。***在调节RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放中的作用。MT浓度分别选取为0.01 m M、0.1 m M、1 m M、10 m M和100 m M,与CoCl致缺氧后的RAW264.7巨噬细胞共培养,Western blot检测RAW264.7巨噬细胞中HIF-1α、NF-κB和p-NF-κB蛋白含量的变化。***通过调节RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放在激活卵巢生殖干细胞中的作用。取21天昆明小鼠卵巢和RAW264.7巨噬细胞共培养,分空白组、缺氧组(100μM CoCl)、褪黑素治疗组(含100μM CoCl和0.01 m M MT)三组。ELISA检测细胞培养液中免疫因子TNF-α和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)水平;Western blot检测RAW264.7巨噬细胞HIF-1α、NF-κB和p-NF-κB的蛋白含量,并检测小鼠卵巢中小鼠脉管同源物(mouse vasa homolog,MVH)和八聚体结合蛋白-4(octamer-binding protein-4,OCT-4)的含量变化,同时通过免疫组化的方法观察MVH和OCT-4的分布差异。结果1.筛选了CoCl致RAW264.7巨噬细胞缺氧模型的适宜浓度和作用时间。50-150μM CoCl呈剂量依赖性引起巨噬细胞RAW264.7 HIF-1α和VEGF蛋白以及炎症因子TNF-α以及NO含量上升(P0.01),在100μM CoCl上述指标的变化即具有显著意义。表明,CoCl导致RAW264.7巨噬细胞缺氧的合适浓度为100μM,故选取100μM CoCl用于后续实验。100μM CoCl和RAW264.7巨噬细胞作用后的0、15、30 min和1、2、4、8、12、24 h等不同时间,Western blot检测,在作用8 h左右HIF-1α表达量最高;NF-κB表达没有随着时间的推移发生变化;p-NF-κB在30 min时表达量明显最高,以此确定后续MT加药时,检测HIF-1α的变化量时CoCl孵育8 h收样,检测p-NF-κB的变化量时CoCl孵育30 min收样。***能减轻CoCl致RAW264.7炎症因子释放中的作用。MT与缺氧RAW264.7巨噬细胞共孵育,能够显著降低HIF-1α的表达:Western blot结果显示,0.01 m M MT组与缺氧模型组相比,HIF-1α明显降低(P0.01)。同时,MT抑制RAW264.7巨噬细胞缺氧炎症反应:Western blot结果显示,不同浓度MT依据对NF-κB表达不产生影响,却可显著抑制p-NF-κB的表达,0.01m M MT组与缺氧模型组比,p-NF-κB表达量显著下降(P0.01)。3.缺氧巨噬细胞与卵巢组织共培养,MT可改善CoCl诱导的RAW264.7巨噬细胞缺氧。通过MT干预实验发现,治疗组和缺氧组比较,治疗组HIF-1α的蛋白表达量明显减低(P0.01),而且治