基于DNAzyme和等温扩增反应的特定位点RNA甲基化检测新方法研究

作     者：余红艳 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢国明

授予年度：2022年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：N6-甲基腺苷 DNAzyme 指数扩增反应 CRISPR-Cas12a 生物传感器 

摘      要：目的:N-甲基腺苷(m6A)在生理过程和肿瘤发展中具有重要意义。对特定基因位点的RNA修饰进行可靠的定量分析,在阐明RNA表观遗传学编码的致病机制中至关重要。然而由于m6A RNA的核苷酸序列没有任何变化且m6A位点不受化学修饰的影响导致对其进行准确定量分析仍存在挑战。因此,建立简单、特异的m6A RNA分析方法十分必要。本研究创新性地将m6A敏感的新型DNAzyme和三向结介导的指数扩增反应结合,并利用CRISPR Cas的侧切效应,建立了电化学和荧光生物传感器,可实现对m6A RNA的直接检测。该方法建立在以下事实之上:DNAzyme两侧的序列与特定位置的m6A的两侧结合;其核心结构选择性切割未修饰的腺嘌呤而不是甲基化的腺嘌呤;等温扩增反应进行信号放大。本研究将为m6A RNA的分析提供一个新的策略,并促进其在表观遗传学中的研究和临床疾病检测中的应用。方法:1.荧光生物传感器的构建:基于三向结诱导的邻位连接效应及基于切口酶和聚合酶的指数扩增反应构建一种特异的荧光生物传感器。运用Nu PACK模拟软件,熔解曲线和非变性PAGE对三向结的形成进行表征和验证;应用PAGE、实时荧光定量检测PCR仪等对DNAzyme酶切和TWJ-ECR的可行性进行验证;对反应中Bst聚合酶与Nt.Bsr DI核酸内切酶的浓度、反应时间、反应温度和反应缓冲液等进行优化;评估该检测系统的分析性能,计算线性公式。2.电化学生物传感器的构建:利用扫描电子显微镜(SEM),透射电子显微镜(TEM)、能量色散光谱(EDS)和紫外-可见光谱(UV-vis)等对合成的材料进行表征;采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对制备的生物传感器进行表征;方波伏安法(SWV)验证m6A RNA检测方法的电化学可行性;对探针密度和CRISPR Cas的切割时间等条件进行优化;评估该检测系统的分析性能,计算线性公式;对传感器的重复性和稳定性进行评价。3.生物传感器在生物样本中的分析:评估该检测系统在复杂的生物基质中的检测能力;分析其对细胞提取RNA的检测能力;验证该方法用于FTO去甲基化功能评价的能力。结果:1.用多种实验方法对三向结诱导的等温指数CRISPR反应进行可行性验证,结果表明该策略可实现特定位点的m6A RNA的特异性识别和扩增。2.基于三向结诱导的等温指数CRISPR反应的分析性能和在生物样本中的分析:可以对MATAL1-2577位点的m6A RNA进行特异性识别,有效鉴定低至1%的m6A RNA;荧光线性范围在1%-40%之间;该方法的重复性较好;电化学传感器10天内的稳定性良好;在血清样本中的抗干扰能力较强;可用于分析细胞样本中的特定位点m6A RNA。结论:本研究提出了一种基于DNAzyme和邻位连接介导的指数扩增反应的传感策略,实现特定位点RNA甲基化的无抗体检测。该传感器利用了DNAzyme特异性切割未甲基化的RNA和甲基化的RNA产生的邻位效应。随后EXPAR和CRISPR Cas12a辅助指数扩增的整合,实现低至1%m6A修饰的敏感检测。证明了所提出的传感系统在复杂生物样品检测中的可行性,并显示了对FTO脱甲基能力评估的潜力。且通过改变报告DNA的类型,基于Cas12a的传感策略可以使用不同的信号输出方式。此外,CRISPR Cas产生的荧光是由EXPAR产物特异性触发的,与使用SYBR Green等核酸染料相比,它可以更好地监测反应过程。最后,由于既不需要精确的热循环也不需要热稳定酶,这种基于等温扩增的方法比RT-PCR更合适。因此,我们预期所构建的方法将为生物医学研究和临床精准医学中位点特异性m6A RNA的分析提供一个新策略。