沙门氏菌噬菌体的微囊化及其抑菌效果研究

作     者：周瑜桥 

作者单位：浙江工商大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曲道峰

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：沙门氏菌 噬菌体 微囊化 体外消化 Caco-2模型 

摘      要：如今耐药形势愈发严峻,沙门氏菌作为常见的食源性病原菌,对人类的健康造成了极大的威胁,急需寻找一种新型的治疗方法来代替传统的抗生素治疗。噬菌体疗法具有特异性强、自我增殖、安全、来源广泛等优点,是一种十分具有前景的生物防治技术。但通过口服噬菌体治疗肠道致病菌时,噬菌体易遭到胃酸破坏而失活。因此需要利用微囊化技术保护噬菌体,同时控制噬菌体在合适的部位释放。目前,对治疗肠道致病菌的噬菌体微胶囊的研究相对简单,并且鲜有利用细胞模型来探究噬菌体的抑菌效果。由于沙门氏菌不仅会黏附于肠壁,还会通过内吞作用进入细胞,本文制备了载噬菌体脂质体,以期借助脂质体与细胞的融合、内吞作用,将噬菌体运送进细胞内部以裂解胞内感染菌。为增加到达肠道的噬菌体滴度,并控制其释放,对噬菌体脂质体进行二次包埋。主要研究内容及结果如下:(1)以鼠伤寒沙门氏菌LT为宿主菌从养殖场的环境污水中分离噬菌体,并对分离得到的3株噬菌体进行生物学性状研究。利用透射电镜观察噬菌体的形态,采用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价以及最佳感染复数、一步生长曲线、温度、pH值、氯仿和胆盐敏感性等生物学特性。结果显示,三株噬菌体均属于尾病毒目,在氯仿和胆盐较为稳定,对高温敏感,在pH≤3和pH≥13的环境中极易失活。最后筛选出一株潜伏期短、爆发量高的烈性噬菌体p SLT23作为后续包封和抑菌实验的研究对象。(2)为保证噬菌体的滴度与活性,提高其抑菌效果,使用微囊化技术包封噬菌体。首先利用Box-Behnken响应面法优化制备了噬菌体负载脂质体的混合液,条件为:卵磷脂与胆固醇质量比为5.99:1,噬菌体投入量为117.47μL,超声时间为14 min,包封率为50.2%。再利用海藻酸钠(ALG)和κ-卡拉胶(CG)将噬菌体进行二次包封,制备了pH响应型ACLP微胶囊,包封率为97.4%。并考察其在体外模拟消化的稳定性与释放特性。结果表明2.0%ALG,0.3%CG的比例制得的ACLP微胶囊具有良好的保护性和控释效果。在SGF中(pH 1.5)噬菌体损失滴度仅为0.12 Log PFU/m L,并且在进入SIF(pH 7.0)后30 min内能迅速释放出大量的噬菌体,并且随着时间的进行能够持续释放出几乎所有的噬菌体。这为噬菌体微囊化技术的开发提供了新的应用参考。(3)建立鼠伤寒沙门氏菌感染Caco-2细胞模型,从细胞存活率、沙门氏菌消除效果和炎症相关基因的表达情况,综合考察了微囊化噬菌体的抑菌效果。结果表明噬菌体及其微囊化制剂都可以显著降低感染细胞的沙门氏菌的数量,提高细胞的存活率(P0.05)。并且,经脂质体和ALG、CG包埋的微囊化噬菌体可以借助脂质体的作用进入细胞以消除胞内感染的沙门氏菌。通过对炎症相关基因的检测,发现噬菌体的加入可以显著抑制沙门氏菌引起的细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的上调(P0.05),促进抑制炎症因子IL-10的上调(P0.05)。综上所述,分离得到的沙门氏菌噬菌体对沙门氏菌具有良好的抑菌效果,用脂质体、海藻酸钠和卡拉胶对噬菌体进行微囊化,可以提高噬菌体的活性并控制其在肠道的缓释。包封在脂质体中的噬菌体可借助脂质体能与细胞融合的特性,被运送进细胞内部,以消除胞内感染的沙门氏菌,提高了噬菌体的抑菌效果。本研究为噬菌体微囊化提供了一种新的有效模型,对其释放规律及抗菌效果的探究为噬菌体在动物细菌性疾病防治中的应用奠定了基础,对动物性食品的质量与安全具有重要意义。