辣椒素受体TRPV1对牙周炎的调控作用及机制的初步研究

作     者：徐小露 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周智

授予年度：2022年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：TRPV1 人牙周韧带细胞 PI3K/AKT 实验性牙周炎大鼠 牙槽骨丢失 

摘      要：背景:TRPV1也称辣椒素受体,在许多炎症性疾病中出现上调的表现,在牙周炎中也有报道;然而,其在牙周炎中的生物学功能和分子学机制尚未明确。目的:本实验从体内体外两个层面研究辣椒素受体TRPV1在牙周炎中的表达、机制和功能,探讨PI3K/AKT信号通路是否能够介导辣椒素受体TRPV1调控牙周炎症,为临床上该疾病的治疗奠定新的理论和实践基础。材料与方法:第一部分:牙周炎细胞和动物模型中辣椒素受体TRPV1的表达情况分析:酶解组织块法培养HPDLCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原,脂多糖刺激HPDLCs构建牙周炎细胞模型。SD大鼠龈沟内结扎构建实验性牙周炎（Experimental periodontitis,EP）大鼠模型,四周后通过形态学观察、苏木素-伊红（HE）染色以及牙槽骨吸收值检测等方法对大鼠建模情况加以验证。随后,切取牙周炎大鼠及其对照组的牙周组织（包括牙齿）包埋切片,进行TRPV1的免疫组化染色;通过q RT-PCR和WB检测牙周炎细胞、牙周炎大鼠及二者的对照组中TRPV1以及炎症因子的表达情况。第二部分:PI3K/AKT通路介导辣椒素受体TRPV1调控牙周炎的机制探讨:WB检测牙周炎细胞、牙周炎大鼠及二者的对照组中PI3K/AKT信号通路相关蛋白,验证不同状态下该通路表达情况的差异性。随后,SD大鼠牙周注射PI3K/AKT通路抑制剂LY294002（LY）,并同期构建牙周炎模型,建模完成后进行下游炎症因子m RNA、蛋白的检测以及牙槽骨吸收值的测量分析。应用TRPV1激动剂辣椒素（Capsaicin,CPS）和拮抗剂辣椒平（Capsazepine,CPZ）对同期牙周结扎的大鼠进行干预,进一步验证TRPV1调控牙周炎的机制;q RT-PCR和WB检测TRPV1和促炎细胞因子的表达;WB检测PI3K和AKT的磷酸化情况;体式显微镜下图像采集并测量分析各组牙槽骨吸收情况。结果:第一部分:通过酶解组织块法成功获得了HPDLCs,流式检测结果显示CD31、CD45、CD73、CD90、CD105分别为1.34%、1.59%、99.2%、95.2%、93.2%。10ug/ml LPS刺激HPDLCs成功构建了牙周炎细胞模型,q RT-PCR和WB结果显示LPS组HPDLCs中TRPV1、炎症因子的m RNA和蛋白表达均较对照组上升。结扎法构建牙周炎大鼠模型,四周后建模大鼠牙龈红肿出血、附着丧失明显、且牙齿出现了不同程度的松动。q RT-PCR、WB检测TRPV1、炎症因子的表达情况与体外实验结果一致。第二部分:WB结果显示,体内体外牙周炎模型中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值较其对照组增加。抑制PI3K/AKT通路后,结扎引起的牙周组织炎症反应明显缓解,炎症因子表达下降,且牙周破坏程度有所减少。另外,牙周局部应用TRPV1激动剂辣椒素上调了PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平,加重了牙周炎症反应以及骨丢失情况;而辣椒平产生了相反的作用。结论:TRPV1可能通过调控PI3K/AKT通路影响促炎介质的表达,进而改变牙槽骨的吸收破坏进程。