核纤层蛋白A/C协同SIRT1调控HBV核心启动子转录的作用

作     者：蒋林珊 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈维贤

授予年度：2022年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：乙型肝炎病毒 核纤层蛋白A/C 沉默调节蛋白1 HBV核心启动子 

摘      要：目的:LaminA/C在多种疾病的进程中发挥了重要的作用。然而,Lamin A/C与HBV感染未见报道。本研究旨在解析Lamin A/C在HBV复制与转录的作用。方法:（1）在HepG2细胞中,转染质粒HBx和HBV1.3,用HBx抗体免疫沉淀蛋白复合物,利用LC-MS筛选与HBx相互结合的蛋白;Co-IP 和 Western-Blot（WB）检测 HBx 和 Lamin A/C 相互作用;免疫荧光技术检测HBx和Lamin A/C的共定位。（2）在HepG2细胞中,转染 pcDNA3.1,pcDNA3.1-HBV1.1,pcDNA3.1-HBV1.3,采用 WB 检测Lamin A/C的蛋白表达;同时,WB检测HepG2.2.15细胞中Lamin A/C的蛋白表达;在Huh7细胞中,转染HBx,WB检测Lamin A/C的磷酸化水平。（3）在HepG2.2.15和HBV感染的HepG2-NTCP细胞中敲减LaminA/C,在 HepG2-NTCP 细胞中过表达 Lamin A/C:WB 检测 HBV Core 水平;Real-time PCR（RT-PCR）检测 3.5kb RNA 的水平;Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）检测 HBV 复制中间体和 HBV cccDNA 的表达水平。在HepG2.2.15细胞中,敲减SIRT1后,RT-PCR检测3.5kb RNA的水平,qRT-PCR检测HBV复制中间体。（4）在Huh7细胞中:过表达质粒SIRT1,Co-IP和WB检测Lamin A/C与SIRT1相互结合;敲减 LMNA 或 SIRT1 后,过表达 pGL-Xp、pGL-Cp、pGL-Sp1、pGL-Sp2,双荧光素报告基因实验检测四个启动子的活性;过表达pGL-Cp,ChIP-PCR检测LaminA/C与Cp序列的结合情况。（5）在Huh7细胞中,同时敲减Lamin A/C和过表达SIRT1、pGL-Cp后,双荧光素酶报告基因实验检测Cp启动子的活性。结果:HBx与Lamin A/C在细胞核内有结合。与对照组相比,转染了 HBV或HBx的细胞中Lamin A/C蛋白表达水平明显增高,且HBx抑制了 Lamin A/C在Ser392位点的磷酸化。敲减Lamin A/C后,HBV Core蛋白、HBV 3.5 kb RNA和HBV复制中间体的表达水平降低;过表达Lamin A/C后,HBV 3.5 kb RNA和HBV复制中间体的表达水平升高。Lamin A/C与SIRT1有相互作用,二者都可影响Cp启动子的活性。此外,敲减Lamin A/C,过表达SIRT1后Cp启动子活性升高的程度较对照组低。结论:我们的研究首次发现了 Lamin A/C可以和HBx相互作用。HBx能抑制Lamin A/C Ser392的磷酸化。Lamin A/C能够协同SIRT1调控HBV核心启动子的活性。