烟酰胺核糖通过eNOS对坏死性小肠结肠炎的保护作用及其机制研究

作     者：张霄 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邱林

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：坏死性小肠结肠炎 氧化应激 烟酰胺核糖 内皮型一氧化氮合酶 肠道微循环 

摘      要：目的:研究烟酰胺核糖(NR)是否通过内皮型一氧化氮合酶(e NOS)信号通路改善坏死性小肠结肠炎(NEC)的严重程度。方法:(1)将80只1日龄的C57BL/6新生鼠(WT)按照随机数字法分为四组:NEC+NR组(n=20),NR组(n=20),NEC组(n=20)以及对照组(n=20)。NEC组新生鼠接受NEC建模处理(配方奶灌胃、缺氧和冷刺激),对照组新生鼠与母鼠同笼接受母乳喂养。其中NR组接受NR处理,对照组接受vehicle处理,NR和vehicle处理指在NEC建模前30分钟腹腔注射NR(300mg/kg)以及等量生理盐水(vehicle)。建模中观察小鼠体重变化,3日后取材。HE染色观察小鼠小肠组织病理学变化;相应的试剂盒检测肠内NAD+水平、一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O)含量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及其分型等;异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)检测肠道屏障功能;Western blot检测去乙酰化酶1(SIRT1)、内皮一氧化氮合酶(e NOS)、乙酰化内皮一氧化氮合酶(Acetyl-e NOS)、一氧化氮合成酶(i NOS);RT-PCR检测小鼠肠道e NOS、toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)m RNA。(2)将40只1日龄的C57BL/6新生鼠(WT)按照随机数字法分为两组:NEC+NR+L-NMMA组以及NEC+vehicle+L-NMMA组,NEC及NR处理同前,L-NMMA处理指在NR处理前1小时给予一氧化氮合酶抑制剂(30mg/kg)腹腔注射,与其他小鼠一同检测肠道O及NO含量。(3)引入e NOS小鼠,建模及处理方式同前。使用免疫荧光检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)和血小板内皮细胞粘附分子(CD31);Western blot检测CD31和VEGFR2蛋白水平。结果:(1)NR有效缓解了NEC建模小鼠的体重减轻情况,减轻了NEC小鼠的肠道损伤,同时NEC组小鼠小肠组织病理学评分较NR+NEC组显著升高(P0.05);(2)NEC组小鼠小肠组织NAD水平较对照组显著降低(P0.05),经过NR预处理后,NR+NEC小鼠NAD水平显著升高(P0.05);(3)NEC小鼠小肠组织对比对照组,谷胱甘肽(GSH)含量显著降低(P0.05),氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量显著升高(P0.05),经过NR预处理后,NEC组小肠组织GSH含量上升,GSSG含量下降(P0.05);(4)NEC组小鼠小肠组织对比对照组MDA水平较显著升高(P0.05),经过NR预处理后,NEC小鼠MDA水平显著降低;(5)经过NR预处理后,可有效提高超氧化物歧化酶(SOD)活性(P0.05),且根据分型,NR主要促进SOD2的活性,而不促进SOD1的活性;(6)NEC组对比对照组小鼠小肠组织中O含量显著增加,NO含量显著减少(P0.05)。当NR预处理后,NR+NEC组对比NEC组O含量显著减少,NO含量显著增加。当用了一氧化氮合成酶抑制剂(L-NMMA)后,NR作用无效。(7)由于NEC损伤肠道黏膜屏障,NEC对比对照组,FITC-葡聚糖渗出增加,加入了NR后,保护了NEC肠道屏障功能;(8)经过L-NMMA处理后的NR+NEC组小鼠不能完成O到NO的转换;(9)免疫荧光结果显示,NR+NEC组对比NEC组Brd U及CD31表达量增加,而e NOS小鼠即使给予NR预处理,Brd U及CD31表达量不变;(10)NEC与对照组比较,SIRT1活性降低,e NOS增加,i NOS增加,NR预处理可以逆转SIRT1和e NOS的改变,但不能逆转i NOS的改变;(11)NR+NEC组对比NEC组,TLR4m RNA水平降低,TNF-αm RNA水平降低。结论:NR能够缓解NEC小鼠的肠道损伤,其作用机制可能与NR通过SIRT1影响e NOS乙酰化/去乙酰化调节有关。