二至丸对黑素细胞分化及高氧化应激态下粘附作用的影响

作     者：吉慧慧 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭城

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：二至丸 黑素细胞分化 黑素合成相关蛋白 过氧化氢 细胞粘附 细胞骨架 粘附相关蛋白表达 

摘      要：第一部分二至丸对人黑素细胞分化的影响目的对二至丸进行体外实验,检测二至丸水提物对原代黑素细胞的增殖、黑素量及黑素合成相关蛋白影响。方法（1）选择包皮手术后的皮肤组织进行原代细胞培养,获取人表皮黑素细胞及角质形成细胞。（2）设定空白对照组（不添加药物）、以及50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml不同浓度的二至丸组,CCK-8检测不同浓度的二至丸水提物对人原代黑素细胞增殖的影响,NaOH裂解法检测不同浓度二至丸对原代黑素细胞的黑素合成的影响。（3）根据前期增殖及黑素含量的结果,选择差异明显干预组进行后续western blot实验,采用western blot从蛋白水平分析酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TRP1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TRP2）及小眼畸形相关转录因子（MITF）的表达。结果（1）二至丸在浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时黑素细胞的增值率分别是空白组的113.5%、116.9%、118.9%、116.5%,与空白组的增值率相比,差异有统计学意义（P0.05）。（2）黑素含量测定:二至丸在浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时的黑素含量分别是空白组的108%、114.7%、115%,与空白组相比,差异具有显著性（P0.01）。（3）200μg/ml、400μg/ml二至丸水提物组MITF的蛋白表达分别是空白组的189%、165%显著高于空白组,差异有统计学意义（P0.05）。100μg/ml、200μg/ml二至丸组TYR的蛋白表达是空白组的132%、145%优于空白组,差异具有显著性（P0.05）。100μg/ml、200μg/ml二至丸组TRP1蛋白表达是分别为空白组的125%、127%,差异具有显著性（P0.05）。200μg/ml、400μg/ml二至丸组TRP2蛋白的表达分别是空白组的138%、153%显著高于空白组,差异有统计学意义（P0.05）。结论二至丸具有促进黑素细胞增殖分化,黑素量及MITF、TYR、TRP1和TRP2蛋白表达的作用。二至丸可能通过上调MITF、TYR、TRP1和TRP2的蛋白表达,特别是MITF的表达来促进黑素细胞分化成熟。第二部分二至丸对高氧化应激态下人黑素细胞粘附功能及相关调控分子表达的影响目的:在H2O2作用下观察二至丸对人黑素细胞与角质形成细胞间粘附、黑素细胞与Ⅳ胶原粘附的影响,以及二至丸对黑素细胞骨架变构和相关粘附蛋白表达情况的影响。方法（1）设立空白对照组、H2O2模型组、H2O2+100、200、400μg/ml二至丸组观察黑素细胞与角质形成细胞的粘附状况。（2）建立空白对照组、HO2模型组、H2O2+100、200、400μg/ml二至丸组,运用CCK8法检测黑素细胞与Ⅳ胶原的粘附。（3）采用鬼笔环肽对人黑素细胞骨架F-actin进行荧光标记,免疫荧光显微镜观察H2O2作用下二至丸对人黑素细胞骨架变构的影响。（4）采用western blot从蛋白质水平分析Ecad、β-catenin、CCN3、DDR1 的表达。结果（1）与空白对照组相比,H2O2模型组黑素细胞与角质形成细胞的粘附率为36%,明显降低（P0.05）。100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的二至丸组的粘附率分别为空白组的45%、67.7%、73.3%均比H2O2模型组高,差异有显著性（P0.05）。（2）H2O2模型组黑素细胞与Ⅳ胶原的粘附率是空白对照组的51.2%,明显低于空白组（P0.05）。1 00μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的二至丸组的粘附率分别为空白组的67.1%、76.9%、78.3%,均高于H2O2模型组（P0.05）。（3）鬼笔环肽对人黑素细胞骨架F-actin进行荧光标记,镜下显示:空白组F-actin排列整齐纤长,清晰可见。H2O2组微丝肌动蛋白短粗,细丝紊乱。各二至丸组虽然微丝蛋白排列略紊乱,但可见细胞突较明显。其中400μg/ml组细胞突起较其他组更多。（4）①与空白组相比,H2O2模型组Ecad的表达量是空白组的27.5%,明显低于空白组,差异有统计学意义（P0.01）。100μg/ml、200μg/ml、40Hμg/ml二至丸预处理组Ecad表达量分别是空白组的62.1%、73.8%、82.7%,与H2O2模型组相比,明显高于模型组,差异具有显著性（P0.001）②与空白组相比,H2O2模型组、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml二至丸组β-catenin蛋白表达量分别是空白组的26.8%、51.8%、71.3%、79.4%,与H2O2模型组相比,空白组及二至丸组β-catenin