双酚A干扰lncRNA Fhad1os2与RUNX3的互作影响青春期小鼠卵巢发育的分子机制研究

作     者：张艺蕾 

作者单位：阜阳师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴风瑞

授予年度：2022年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：BPA 青春期卵巢发育 雌激素受体 lncRNA Fhad1os2 RUNX3 

摘      要：BPA(Bisphenol A)是环境中能普遍检测出的一种典型的环境内分泌干扰物,在生活中常通过消化系统进入体内,紊乱生物体正常的生命活动。现已有大多数研究表明BPA暴露与女性卵巢功能障碍有关,包括不孕、多囊卵巢综合征等。青春期作为青少年获得生殖能力以及性器官发育完全的关键时间段,体内的生殖激素正处于一种相互协调且不断变化的状态,此阶段暴露BPA会导致青少年更易受到影响,并引起青少年早熟以及后续生殖系统发育不全等。关于BPA对卵巢转录组异常调控的相关分子机制尚不清楚,被广泛接受的一种说法是,由于其与雌激素结构类似,可与不同细胞类型中雌激素受体α/β形成配体-受体复合物,产生类雌激素效应,并进一步与靶基因转录调控区域雌激素应答元件结合,扰乱生物体基因或者非编码RNA的表达,最终导致组织、器官发育异常。非编码RNA亦可作为转录调控的重要分子,在卵巢发育过程中对各细胞之间信息沟通的作用不可忽视。本研究基于课题组前期转录组测序结果,以∣LogFold Change∣≥1为标准,进一步对青春期小鼠卵巢中转录组测序数据进行分析,在BPA暴露后的青春期小鼠卵巢中筛选出一个受BPA调控的基因Fhad1。对其进行基因结构分析发现,在其下游相反转录方向存在一个长链非编码RNA(lncRNA Fhad1os2)。通过RT-q PCR发现在BPA暴露青春期小鼠卵巢和小鼠卵巢颗粒细胞KK-1中,Fhad1和lncRNA Fhad1os2的表达水平均被下调。荧光原位杂交发现二者主要定位于小鼠卵巢颗粒细胞中,且lncRNA Fhad1os2相对于Fhad1在颗粒细胞中的荧光强度更高。细胞增殖实验表明lncRNA Fhad1os2参与卵巢颗粒细胞增殖过程,暗示lncRNA Fhad1os2可能与卵巢发育和颗粒细胞功能维持有关,并可能参与雌激素合成和雌激素信号介导的基因转录调控。通过BPA暴露小鼠卵巢颗粒细胞KK-1并添加合适浓度的雌激素受体激动剂以及抑制剂,我们发现当加入ERα(Estrogen receptorα)激动剂PPT(Propyl pyrazole triol)后lncRNA Fhad1os2的表达水平被升高,而ERβ(Estrogen receptorβ)激动剂DPN(Diarylpropionitrile)对其无影响,抑制剂结果与激动剂趋势相反,表明BPA可能通过与ERα结合调控lncRNA Fhad1os2表达而非与ERβ结合。为揭示BPA暴露下lncRNA Fhad1os2表达水平变化对青春期小鼠卵巢发育影响的分子机制,我们通过带生物素标记的lncRNA Fhad1os2探针,利用RNA pull-down技术寻找与lncRNA Fhad1os2互作且影响卵巢发育的相关分子,发现对照组lncRNA Fhad1os2的pull-down蛋白与BPA组的确存在差异。通过质谱检测后发现,BPA的暴露使得青春期小鼠卵巢中的雌激素信号、孕酮介导的卵泡成熟过程等信号通路异常。结合已有转录组测序分析,我们筛选出另一个转录和蛋白水平受BPA影响并与lncRNA Fhad1os2结合的转录因子RUNX3,并通过物理性互作分析加以证实。卵巢发育离不开雌激素的参与,而小鼠芳香化酶Cyp19a1是雌激素合成的关键酶,我们通过loss-of-function和gain-of-function研究发现,敲低Runx3后则可使小鼠芳香化酶Cyp19a1 m RNA表达水平和雌激素水平下调,过表达RUNX3则反之,表明RUNX3可调控Cyp19a1转录和雌激素合成能力。进一步敲低lncRNA Fhad1os2后发现小鼠Runx3的m RNA和蛋白表达水平上调,过表达lncRNA Fhad1os2则使其下调,这表明lncRNA Fhad1os2可通过与RUNX3互作参与青春期小鼠雌激素合成进而影响卵巢发育。综上所述,通过表达谱分析、荧光定位、Western blot、RNA pull-down结合质谱分析等一系列生物化学与分子生物学方法,我们发现BPA通过与ERα形成复合物干扰小鼠卵巢颗粒细胞中lncRNA Fhad1os2表达,影响lncRNA Fhad1os2与RUNX3互作,改变雌激素合成关键酶CYP19A1活性和雌激素合成能力,使青春期小鼠卵巢发育异常。本研究结果不仅丰富了非编码RNA参与调节卵巢发育理论,为环境雌激素干扰组织和器官发育奠定基础,也为青春期儿童卵巢发育和后期生殖能力维护打开一扇新的窗口。