SfAbd-B和SfHth基因在草地贪夜蛾后腹部发育过程中的功能研究

作     者：邱琪琪 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵特

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：草地贪夜蛾 Abd-B Hth CRISPR/Cas9 

摘      要：Abdominal-B（Abd-B）基因作为昆虫Hox基因家族最靠后的成员,主要决定昆虫后部体节的形态特征及附肢发育。Homothorax（Hth）基因属于TALE同源域蛋白质亚家族,既与特定域结合增加Hox蛋白的调控活性,又参与昆虫附肢的形成。基于前期研究和文献积累,推测SfAbd-B、Sf Hth基因参与调控草地贪夜蛾后腹部发育,但具体调控机制尚不清楚。本学位论文采用CRISPR/Cas9技术对SfAbd-B、Sf Hth基因进行定向编辑,结合RNA-seq技术和q RT-RCR技术对基因功能进行探究,主要研究结果如下:（1）SfAbd-B的敲除:将SfAbd-B-sgRNA和Cas9蛋白显微注射到草地贪夜蛾胚胎,观察到突变胚胎出现后部体节和腹足严重缺陷表型,胚胎致死率极高。突变幼虫后腹部出现过剩足和体节融合表型,突变蛹出现色素缺失、发育缺陷及体节偏移表型,突变成虫出现外生殖器增生、偏移或畸形等缺陷。DNA测序显示SfAbd-B突变体在靶标位点发生了碱基插入、缺失和替换导致的移码突变。利用q RT-PCR检测突变成虫外生殖器中附肢发育相关基因的表达情况,结果显示突变雌性和雄性成虫生殖节中Dpp、Cp12表现为下调,Hth、Lab、En、Exd均在雌性中呈上调趋势,在雄性中呈下调趋势。（2）SfAbd-B突变胚胎的RNA-seq结果分析:对SfAbd-B突变胚胎和同时期野生型胚胎进行转录组测序及生物信息学分析,GO分析显示SfAbd-B基因对胚胎发育的影响主要集中在分子功能上,富集最显著的条目是角质层的结构组成,该条目下的表皮蛋白基因均下调显著。KEGG分析显示SfAbd-B基因主要与核糖核酸聚合酶通路相关,注释到该通路的基因均发生下调。将差异基因按差异倍数排序,10个下调最明显的差异基因中7个被注释到表皮蛋白基因家族,表明SfAbd-B基因通过正向调控表皮蛋白基因的表达参与胚胎形成。（3）Sf Hth的敲除:将Sf Hth-sgRNA和Cas9蛋白显微注射到草地贪夜蛾胚胎,观察到大量突变胚胎无法正常孵化,解剖发现后腹部严重畸形。突变幼虫产生过剩足、腹足趾钩退化、蜕皮或化蛹困难表型。突变蛹表型为生殖孔缺陷、第9、10腹节表皮焦化或缺失。Sf Hth与SfAbd-B突变体存在相似表型。DNA测序显示Sf Hth突变体在靶标位点发生碱基插入、缺失和替换导致的移码突变。通过q RT-PCR检测Sf Hth突变胚胎中躯体形成相关基因的表达量,结果显示附肢模式基因中Abd-B、Dac、En、Exd、Dpp、Lab基因发生下调,Dll和Ix基因发生显著上调。表皮蛋白基因Cp12、Cp19以及Lcp A3A均下调明显,Cp7、Cp18.6和sg Abd-6基因与野生胚胎相比接近不表达。