拟南芥CML48基因克隆及功能分析

作     者：刘汉青 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋杰

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：盐胁迫 拟南芥 Ca2+ CML48 

摘      要：CML(Ca M-like protein)作为植物特有的钙离子潜在传感器,属于钙结合相关的EFh型蛋白超家族,该家族成员均有高度保守的EFh型结构域,盐分可刺激CML表达。目前关于拟南芥CML48(At2g27480)基因研究仅停留在注释,具体功能尚不清楚。本实验克隆拟南芥CML48基因,测定野生型拟南芥、过表达和突变体株系盐处理下的生理指标,并通过q RT-PCR分析盐胁迫时各株系相关盐响应基因的表达,对该基因响应盐胁迫机制进行了初步研究。结果如下:1.拟南芥CML48基因克隆、生物信息学分析及亚细胞定位CML48基因序列为687 bp,编码228个氨基酸,属于亲水蛋白。具有两个典型钙结合相关的EFh型保守结构域,属于EFh蛋白超家族。无跨膜螺旋区,也没有信号肽。本实验克隆拟南芥CML48基因,构建p CAMBIA2300-35S-GFP-CML48重组质粒,进行亚细胞定位发现该基因定位在细胞核上。2.拟南芥CML48过表达、突变体和回补株系的获得构建pCAMBIA1307-35S-myc-CML48重组质粒,侵染野生型拟南芥获得纯合过表达OE3和OE11株系,通过q RT-PCR分析两个过表达株系CML48基因相对表达量,验证CML48基因已成功在拟南芥中过量表达。三引物法鉴定突变体,获得纯合突变体cml48-1和cml48-2株系,并且获得纯合回补C1和C4株系。3.野生型、过表达株系及突变体株系响应盐胁迫的功能验证目前刚获得回补株系,其响应盐胁迫的各指标正在测定中。分析CML48基因在拟南芥叶片中的表达,发现盐处理情况下CML48基因呈下调趋势。统计并观察各株系的萌发率、发芽势和主根长度,发现非盐处理时各株系均没有明显差异;随盐浓度的增加各株系发芽势和主根长度均显著下降,且过表达株系的发芽势和主根长度低于野生型。说明在萌发期,过表达株系对盐胁迫较为敏感。用0和100 m M Na Cl处理各株系7 d后,发现在非盐处理情况下,各株系的生理指标没有显著差异。但在100 m M Na Cl处理下,各株系的生物量、叶绿素含量均随盐浓度的升高而降低。与野生型相比,过表达株系表现出对盐胁迫的高敏感性。同样,随着盐浓度的升高各株系的Na含量显著上升,K含量显著降低,并且过表达株系中Na含量和Na/K明显高于野生型。取盐处理7天的各株系完整叶片,进行DAB和NBT染色。发现随盐浓度的增加,叶片染色程度随之加深,而过表达株系的叶片颜色最深。可见盐胁迫条件下,过表达CML48拟南芥植株遭受活性氧伤害程度增加。MDA含量测定也验证了盐胁迫下过表达株系的膜脂过氧化程度最严重,说明过表达株系对盐胁迫的耐受性较低。q RT-PCR测定盐胁迫条件下抗氧化酶相关基因At SOD、At CAT、At APX和At POD,以及Na离子转运相关基因At NHX1、At HKT1和At SOS1在野生型和过表达株系中的表达水平,发现除At SOS1表达量没有明显变化之外,其它盐响应相关基因在过表达株系中的表达水平较野生型均降低。初步说明CML48基因可能负调控拟南芥耐盐性,上述结果为深入研究钙结合蛋白基因家族功能提供了一定依据。