两种罗布麻响应UV-B胁迫的转录组学及代谢组学分析

作     者：谢博勋 

作者单位：宁夏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国旗

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：罗布麻属 UV-B辐射 生理指标 转录组学 代谢组学 分子机制 

摘      要：自20世纪80年代以来,平流层臭氧含量降低引起地球表面中波紫外线（UV-B）的增加,给植物的生长和生存造成了很大影响。研究植物UV-B的抗性,从多方面了解植物对UV-B胁迫的防御机制及其损伤修复机制有助于作物抗UV-B品种的培育,也能为植物避免UV-B伤害提供帮助。罗布麻属（Apocynum）植物是夹竹桃科多年生宿根草本植物,具有极强抗逆性和药用价值,但该属植物抗UV-B胁迫的特性尚未报道。因此,本研究以引种于美国的大麻状罗布麻（Apocynum cannabicum）和我国宁夏地区罗布麻（A.venetum）为实验材料,用日辐射剂量为17.52 kJ/（m2·d）的UV-B对其处理,测定照射前、照射后1、4、7天后的光合和抗逆性生理指标。并对大麻状罗布麻的5个时间点（0天、0.5天、1天、4天和7天）,罗布麻的4个时间点（0天、1天、4天和7天）进行转录组学和代谢组学分析。本研究旨在探索两种罗布麻响应UV-B的生理及分子机制,为诠释两种罗布麻的抗UV-B的分子调控机制提供理论支撑。实验结果如下:1、在17.52 kJ/（m2·d）的UV-B胁迫下,随着UV-B处理时间的延长,两种罗布麻的光合作用受到影响。叶绿素荧光参数中的PI abs、PI total、phi（P0/E0/R0）降低,说明二者的PSII和PSI的相对活性受到影响。在大麻状罗布麻中,UV-B提高了电子传递效率和光反应活性,Fm、Fv/Fm、Fv/F0等参数上升,而F0/Fm、Sm/t（Fm）、ABS/RC等下降。而罗布麻的电子传递效率和光反应活性被抑制,dVG/dto、dV/dt0和ABS/Cs0等参数上升,ΨET、RE0/CSm和F0/Fm等参数下降。二者的叶片净光合速率、气孔导度和相对叶绿素含量在UV-B处理1天时短暂上升,随后下降。两种罗布麻的渗透调节物质和酶活性均受到影响。可溶性蛋白含量呈上升趋势,脯氨酸、丙二醛和过氧化氢含量在处理1天时降低后升高。过氧化氢酶和过氧化物酶活性在UV-B处理前4天逐渐上升。另外二者的物质含量和酶活性数值具有较大差异,罗布麻的可溶性蛋白、脯氨酸以及总黄酮含量远多于大麻状罗布麻;而在抗氧化酶活性方面,大麻状罗布麻的过氧化氢酶和过氧化物酶活性远高于罗布麻。说明二者在这些方面的抗UV-B的侧重不同。2、通过有参转录组测序,从大麻状罗布麻（A.cannabicum）叶片中获得了 638,028,206个Clean reads,得到了 21,682个基因,筛选出7,039个差异基因（DEGs）被注释到4个比较组中。从罗布麻（A.venetum）叶片中获得了 501,241,162 个 Cleanreads,得到 21,233 个基因,筛选出 6432 个 DEGs被注释到3个比较组中。这些差异基因在GO富集条目主要与“代谢过程、“细胞过程、“外封装结构、“胞内解剖结构、“催化活性和“结合有关;两种罗布麻显著富集的KEGG通路主要有“类黄酮生物合成、“淀粉和蔗糖代谢、“光合生物的固碳作用、“苯丙烷生物合成和“植物激素信号转导等11个通路。基于差异倍数分别从大麻状罗布麻和罗布麻中筛选出482个和425个与UV-B胁迫相关的关键基因。经过分类发现,这些基因主要参与了以类黄酮为主的次级代谢、以糖脂代谢为主的初级代谢、信号转导和遗传信息表达及调控等过程。为了验证转录组数据的可靠性,本研究分别从两种植物筛选出9个基因进行qRT-PCR实验,试验结果与转录组分析结果一致,证明转录组数据正确。3、通过代谢组分析从两种罗布麻中共鉴定出500种差异代谢物（DEMs）,大麻状罗布麻中有352种,罗布麻中有270种,被分为14个大类,类黄酮占比最多共120种,之后是酚酸类、脂质和氨基酸及其衍生物。这些DEMs主要参与了“代谢途径、“次级代谢物生物合成、“ABC转运体、“氨基酸生物合成4个代谢通路,并通过分类分析表明这些DEMs主要通过吸收UV-B辐射、保护光合结构、维持细胞渗透压和清除活性氧来适应UV-B胁迫。类黄酮多数通过糖基化、酰基化修饰提高其结构稳定性和植物抗逆性。糖类和脂类物质在二者中呈现不同的表达模式,大麻状罗布麻中含有较多的糖类物质,能够在植株应对UV-B的响应过程中供能和作为渗透调节物质维持细胞渗透平衡。在大麻状罗布麻中不饱和脂肪酸含量远大于罗布麻,能够在维持其细胞膜结构中起作用,但也同样具有大量溶血磷脂酰胆碱能破坏细胞结构。4、基于转录组和代谢组数据联合分析,筛选出的类黄酮生物合成相关的基因CYP73A、HCT、C3’H、CHS、CHI、F3H、CYP75B1、DFR和ANS共9种28个基因与6-甲氧基槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-（4-O-葡萄糖基）鼠李糖苷、2’-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖和6-C-甲基槲皮素-3-O-芸香糖苷等25种类黄酮有关。并构建了罗布麻属植物类黄酮的生物合成途径,其中共注释到28个基因,15个代谢物。其中有2种代谢物以肉桂酰辅酶A为反应底物,13种代谢物以对香豆酰辅酶A为反应底物,乔松素、反式-5-O-对香豆酰莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸、柚皮素、柚皮素查尔酮、圣草酚、二氢槲皮素和二氢山奈酚既是前一个代谢途径的产物,又是下一个代谢途径的反应底物。本研究初步揭示了两种罗布麻抗UV-B胁迫的生理及分子适应机制,鉴定了与罗布麻属植物响应UV-B相关的代谢通路、关键基因及代谢物,并构建了两种罗布麻的黄酮类化合物的分子合成途径。本研究填补了罗布麻属植物在抗UV-B研究中的空白,为后续罗布麻属植物在生理生化、基因调控和代谢过程3个方面研究抗UV-B胁迫的适应性机制提供理论支持。