小麦钙调素/类钙调素基因的特征分析、克隆及功能研究
作者单位：河北科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：杜进民;周硕
授予年度：2019年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学]
摘 要：钙调素(CaM)和类钙调素(CML)是植物Ca传感器的主要家族之一,已经在许多植物物种中鉴定了Ca M/CML基因家族的存在,例如模式植物拟南芥和水稻。Ca M/CML可以特异性结合Ca2+,并通过下游的结合蛋白传递信号,广泛参与了植物生长和发育以及对各种外部刺激的反应。本研究根据前期鉴定的232个小麦CaM/CML基因,首先利用生物信息学的方法对基因特征进行分析;然后,通过荧光定量PCR的方法,检测了9个小麦TaCML基因的组织表达特性及非生物胁迫下m RNA表达量的变化,并对其中四个TaCML蛋白进行了亚细胞定位;然后,构建了TaCML46-D的过表达载体,通过转化小麦品种Fielder,初步研究了该基因的功能。主要结果如下:(1)对232个小麦CaM/CML基因鉴定并进行生物信息学分析。CaM/CML蛋白的长度范围为78至1299个氨基酸,分子量范围为8.65 k Da至139.62 k Da,等电点范围为3.70至9.63。预测Ca M蛋白全部位于细胞质中;CML蛋白位于细胞质、细胞外基质、细胞核、壁膜间隙、叶绿体、外膜、线粒体和质膜中。231个Ca M/CML基因分布在21条染色体上,而基因TaCML70-U不能分配到任何特定的染色体上。(2)选择了小麦TaCML11、TaCML13、TaCML24、TaCML31、TaCML33、TaCML46、TaCML68、TaCML74和TaCML75共9个TaCML基因进行了组织特异性检测。除TaCML11在种子中不表达外,TaCML13、TaCML24、TaCML31、TaCML33、TaCML46、TaCML68、TaCML74和TaCML75基因在小麦幼嫩的根、幼嫩地上部分和成熟的根、茎、叶、旗叶、花、种子中均有表达,但表达丰度不同。其中,TaCML75最为显著,幼嫩地上部分的表达量是幼嫩根中97.5倍。(3)检测了以上9个TaCML基因对非生物胁迫的响应。TaCML基因的表达受NaCl、PEG、冷和热激胁迫的诱导或抑制。小麦的不同组织部位,不同TaCML基因的表达对不同的非生物胁迫表现出不同的响应。盐胁迫可以诱导小麦地上部分TaCML31、TaCML33、TaCML46、TaCML74和TaCML75基因的表达,抑制TaCML11、TaCML24和TaCML68基因的表达;诱导小麦根部TaCML31、TaCML33和TaCML75基因的表达,但是抑制TaCML13、TaCML24、TaCML46、TaCML68和TaCML74基因的表达。渗透胁迫可以诱导地上部分TaCML基因的表达;小麦根部TaCML11和TaCML68基因的表达受到抑制。冷胁迫可以诱导小麦地上部分TaCML基因的表达;抑制小麦根部TaCML24和TaCML68基因的表达。热激胁迫处理可以诱导小麦地上部分TaCML31、TaCML74基因的表达,抑制TaCML11、TaCML13、TaCML24、TaCML33、TaCML46、TaCML68和TaCML75基因的表达;诱导小麦根部TaCML11、TaCML24、TaCML31、TaCML33、TaCML46、TaCML68和TaCML75基因的表达,但是抑制TaCML13和TaCML74基因的表达。小麦的不同组织部位,不同TaCML基因的表达对不同的非生物胁迫表现出不同的响应,暗示了CML基因在不同组织中参与了不同的抗逆信号转导通路。基因的表达受到盐、渗透、冷和热激胁迫的影响,可能在小麦抵御胁迫的信号传导过程中起作用。比如,TaCML74基因在地上部分强烈响应热激胁迫,热激30 min时TaCML74基因的表达量是处理前的2622.0倍;TaCML33基因在根部强烈响应冷胁迫;TaCML75基因在根部强烈响应盐、渗透和热激胁迫;TaCML46基因在根部响应渗透、冷和热激胁迫,TaCML46基因在地上部分响应盐、渗透和冷胁迫。(4)通过构建四个类钙调素蛋白TaCML11-A、TaCML31-A、TaCML33-A和TaCML46-D与EGFP蛋白融合的亚细胞定位载体,利用农杆菌浸染烟草叶片的方法,观察到四个类钙调素蛋白在细胞核、细胞质中均有表达。(5)通过构建TaCML46-D过表达载体,转化小麦品种Fielder;共获得11个过表达株系:OE1-OE11,并得到7个过表达纯合株系。对过表达株系进行DNA和RNA水平鉴定以及农艺性状分析,TaCML46-D基因过表达株系相比野生型存在早熟现象,株高和有效分蘖数无规律性变化。
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