IDO2调节免疫微环境在免疫性肝损伤中的治疗应用

作     者：冯影 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闵卫平

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：免疫耐受 免疫性肝损伤 IDO2 T淋巴细胞 刀豆蛋白A 

摘      要：研究背景:肝脏特有的免疫耐受特性在维持肝脏免疫平衡中具有重要的调节作用,这种免疫平衡一旦被破坏,会引发多种免疫相关的肝脏疾病。吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)是一种色氨酸限速代谢酶,与机体的免疫负调节密切相关,在肝脏中的表达居全身器官之首,然而其在肝脏中的免疫调节功能尚未见报道。目的:明确IDO2过表达对肝脏免疫调控的影响及其对免疫性肝损伤的作用,为免疫性肝损伤的治疗提供理论依据。方法:1.构建过表达质粒IDO2-c DNA,q-PCR及Western-blot检测AML12细胞中IDO2-c DNA的体外过表达效果。***-8法检测细胞活性。3.采用种子溶液生长法合成基础材料金纳米棒,在此基础上进行化学修饰靶向分子LA,合成靶向纳米载体LA-GNR。4.琼脂糖凝胶电泳检测纳米载体LA-GNR结合IDO2-c DNA质粒的能力。5.肝肾功能试剂盒检测纳米载体LA-GNR在小鼠体内的肝肾毒性。6.冰冻切片检测纳米载体LA-GNR在体内对肝脏的靶向作用。7.构建BALB/C小鼠免疫性肝损伤模型,尾静脉注射LA-GNR/IDO2-c DNA对免疫性肝损伤进行治疗。***染色法观察LA-GNR/IDO2-c DNA对小鼠肝脏组织形态结构的影响;收集小鼠血清评价小鼠的转氨酶、氧化应激能力以及LDH水平变化;ELISA试剂盒检测炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平的变化;q-PCR法检测肝组织中TNF-α、IL-6、IFN-γm RNA的表达水平。9.流式细胞术检测T淋巴细胞的凋亡、CD4T、CD8T细胞的百分比、NK-1.1细胞的百分比、DC细胞表面共刺激分子表达。结果:1.q-PCR和Western-blot检测结果显示IDO2-c DNA可使AML12细胞的IDO2转录及蛋白表达水平明显提高。2.肝细胞内IDO2过表达可抑制Con A刺激的T淋巴细胞增殖。3.表征测定表明靶向肝脏纳米载体LA-GNR合成成功。4.琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,当LA-GNR与质粒IDO2-c DNA质粒的质量比为6:1时,质粒DNA可与材料完全结合。5.肝肾功能结果显示纳米载体材料对小鼠肝肾无明显的毒性。6.冰冻切片结果显示,经过尾静脉注射LA-GNR/IDO2-c DNA 72h后,LA-GNR/IDO2-c DNA在肝组织中的绿色荧光最强。***染色结果显示,尾静脉注射LA-GNR/IDO2-c DNA可以改善小鼠免疫性肝损伤的病理损伤程度。8.肝功能结果显示,LA-GNR/IDO2-c DNA组的转氨酶水平降低;MDA、SOD水平有明显的差异;LDH水平明显降低;ELISA及q-PCR结果表明LA-GNR/IDO2-c DNA组的炎性因子表达水平降低。9.流式细胞术结果表明,LA-GNR/IDO2-c DNA治疗可以增加T淋巴细胞的凋亡,降低CD4T细胞的百分比,下调NK-1.1细胞的百分比,抑制DC细胞共刺激分子的表达。结论:1.本研究成功构建了一种靶向肝脏组织的新型纳米材料LA-MUA-PEI-GNR(LA-GNR),可以高效地搭载目的基因质粒,实现小鼠体内肝脏特异性目的基因调控。2.通过靶向肝脏体内IDO2过表达,可减轻小鼠免疫性肝损伤的病变,有效抑制肝脏免疫微环境中免疫活性。