HIV-1损伤黏膜细胞连接的分子机制研究

作     者：陈明真 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周军

授予年度：2022年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：细胞连接 紧密连接 微管 微管结合蛋白 stathmin 

摘      要：艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的疾病,其中HIV-1是引发艾滋病的主要致病株。HIV-1的主要传播途径包括母婴传播、血液传播和性传播。性传播中,黏膜上皮接触是HIV-1感染的关键步骤。HIV-1通过增加黏膜通透性,破坏黏膜上皮屏障,促进其病毒传播。黏膜上皮细胞层的细胞连接蛋白复合体形成了黏膜屏障。包括我们课题组在内的研究人员证明,微管的动态组装及其稳定性调节在黏膜上皮屏障稳态维持中发挥着重要的作用。微管的动态性受到微管结合蛋白的调控,其中包括微管解聚蛋白stathmin。我们之前的研究发现HIV-1包膜蛋白gp120可以引起stathmin蛋白水平的降低,导致微管过度稳定,进而破坏细胞连接蛋白复合体,最终促使HIV-1突破黏膜上皮屏障,侵犯人体的免疫系统。但是,这一过程的分子基础尚不清楚,有待进一步研究。在本文中,我们初步探究了HIV-1破坏黏膜上皮屏障以启动其感染周期的分子机制。用假型HIV-1颗粒处理黏膜上皮细胞,实验结果显示HIV-1感染导致细胞的紧密连接及黏附连接破坏、微管稳定性过度增加、stathmin蛋白水平的降低。通过免疫沉淀联合质谱鉴定,我们发现PKG1(protein kinase c GMP-dependent 1)和ADCK3(aar F domain containing kinase 3)是stathmin的相互作用蛋白。进一步地,我们对PKG1和ADCK3进行深入筛选,实验结果表明,PKG1 si RNA敲低细胞内的PKG1蛋白可以回复HIV-1引起的细胞连接损伤,而ADCK3敲低则没有明显效果。因此,PKG1很有可能在HIV-1感染黏膜上皮进程和stathmin分子之间起了重要的桥梁作用。我们推测:蛋白质激酶PKG1很有可能通过磷酸化stathmin在HIV-1感染中发挥作用。免疫沉淀实验证明PKG1与stathmin在体内及体外均相互作用。过表达PKG1增加了stathmin的磷酸化水平,并伴随着stathmin蛋白表达水平的降低。Stathmin蛋白磷酸化质谱分析结果显示,HIV-1 gp120处理细胞后,stathmin的第38位和第63位的丝氨酸位点被磷酸化修饰。进一步的免疫印迹结果显示,stathmin的第63位点的丝氨酸磷酸化水平增加。利用PKG1的抑制剂与HIV-1 gp120共处理细胞后,stathmin第63位点的丝氨酸磷酸化水平降低。更重要的是,PKG1抑制、stathmin-GFP过表达均可以回复HIV-1gp120诱导的细胞连接损伤,而stathmin第63位点丝氨酸磷酸化缺陷突变体的过表达可以更好地恢复细胞连接的完整性。综上所述,我们发现HIV-1暴露会激活PKG1,导致stathmin蛋白的第63位点丝氨酸被磷酸化修饰、微管过度稳定和细胞连接破坏,最终使得黏膜上皮屏障受损。我们的研究结果进一步揭示了HIV-1感染黏膜上皮的分子机制,该机制的揭示有助于制定有效预防HIV-1感染的诊疗策略。