阿育魏实挥发性成分对非酒精性脂肪肝的影响

作     者：阿力米江·奥布力塔力甫 

作者单位：新疆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：古丽巴哈尔·卡吾力

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：阿育魏实挥发性成分 响应面法 GC-MS 网络药理学 非酒精性脂肪肝 

摘      要：目的:利用响应面法考察阿育魏实挥发性成分的提取工艺参数,并采用GC-MS法检测其成分,通过网络药理学推测其药理活性,及用体内外试验验证其对NAFLD的作用。方法:1.以料液比、浸泡时间、超声时间及蒸馏时间为考察因素,以挥发性成分得率为考察指标,通过单因素和响应面法筛选阿育魏实挥发性成分的最佳提取工艺参数;2.通过最佳提取方法得到阿育魏实挥发性成分,并用GC-MS对其化学成分进行定性分析;3.从GEO数据库下载NAFLD数据集,用SVA包进行批次消除,Limma包进行差异基因分析,再通过WGCNA包筛选出关键基因,Deep Purpose包进行DTI分析,CIBERSORT算法进行免疫浸润分析,进行单基因GSEA分析,推测阿育魏实挥发性成分改善非酒精性脂肪肝的药理机制;4.建立非酒精性脂肪肝细胞模型,用阿育魏实挥发性成分干预24 h,通过油红O染色和检测相关指标进一步验证阿育魏实挥发性成分的药理活性;5.高脂饲料联合地塞米松诱导C57BL/6J小鼠建立非酒精性脂肪肝模型,诱导42 d,其中在第7 d之后各给药组分别灌胃相应药物,第42 d末次给药后,禁食12 h,随后采集血清和肝组织;微量法检测各组小鼠血清中TG、TC、AST及ALT含量;ELISA法检测各组小鼠肝脏中白细胞介素-1β、白细胞介素-6,肿瘤坏死因子-α的含量;HE染色观察小鼠肝脏组织的病理学变化;油红O染色观察小鼠肝组织中脂滴的形成和积累变化;RT-PCR法检测小鼠肝脏TNF-α、Rela、IKKβ、CCL2等基因的m RNA表达量;通过蛋白质印迹法和免疫组化法检测小鼠肝组织中MCP-1(CCL2)蛋白的表达量,进一步考察阿育魏实挥发性成分对非酒精性脂肪肝的药理活性。结果:1.当料液比9 m L·g、浸泡时间12 h、超声时间15 min和蒸馏时间6.5 h时,阿育魏实挥发性成分的得率为2.12%;2.GC-MS检测结果显示,阿育魏实挥发性成分中有11种主要化学成分,即麝香草酚、伞花烃、γ-萜品烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、3-蒈烯、2-蒈烯、3-甲基-4-异丙基苯酚、α-松油醇,其中麝香草酚(56.02%)占比最高;3.本研究用GSE89632和GSE63067数据集并进行批次消除得到总表达数据集,其中包括50名NAFLD患者和31名健康对照组。Limma包分析得到765个差异基因,再通过WGCNA分析得到13个模块和130个最相关基因。用Cyto Hubba筛选出10个Hub基因。Deep Purpose结果表明,靶点CCL2(MCP-1)与11种主要化合物结合分数平均值最高为7.39。免疫细胞浸润相关性评估分析结果表明,CCL2(MCP-1)基因与幼稚B细胞、γδT细胞、单核细胞等免疫细胞相关。GSEA分析结果表明,CCL2(MCP-1)与TNF-α/NF-k B通路相关性最大;4.体外试验研究表明,与模型组相比,阿育魏实挥发性成分给药组明显减少NAFLD模型Hep G2细胞中脂滴的形成和积累;5.体内试验研究表明,与模型组相比,阿育魏实挥发性成分可以降低小鼠血清内TG、TC、AST及ALT含量(P0.05);阿育魏实挥发性成分高剂量组可以降低肝组织内IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(P0.05);阿育魏实挥发性成分各剂量组肝脏细胞受损程度低于模型组;阿育魏实挥发性成分各剂量组脂滴形成程度低于模型组;阿育魏实挥发性成分各剂量组降低肝脏组织CCL2、Rela、IKKβ、TNF-α等基因m RNA表达和肝组织MCP-1(CCL2)蛋白的表达;结论:1.通过响应面法考察出来的工艺参数准确、稳定;2.运用GC-MS法测定阿育魏实挥发性成分的主要化学成分及含量是合理、可行,为后期研究提供理论依据和数据支撑。3.阿育魏实挥发性成分改善NAFLD的作用主要是通过靶点MCP-1(CCL2)起作用,其最主要相关通路为TNF-α/NF-k B信号通路;4.体外试验结果表明,阿育魏实挥发性成分明显减少NAFLD模型Hep G2细胞中脂肪的形成和积累;5.体内试验结果说明,阿育魏实挥发性成分通过减少组织中脂肪的形成和蓄积及抑制促炎因子改善小鼠NAFLD。