中心体蛋白CEP72在小鼠精子发生过程中的功能研究

作     者：李常荣 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗孟成

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：中心体 基因编辑技术 减数分裂 精子发生 

摘      要：目的:男性不育是一个重要的公共卫生问题,精子发生异常是男性不育的主要原因之一。中心体作为微管组织中心（MTOC）,由中心粒和周围物质（PCM）组成,对纺锤体形成、染色体分离、胞质分裂等细胞活动至关重要。中心体异常会引发少精症、弱精症、小头症及侏儒症等疾病。CEP家族蛋白构成了中心体周围物质,而CEP72作为成员之一,参与调控了有丝分裂过程中纺锤体组装、微管形成、染色体排列等活动,但其在减数分裂过程中的功能尚未报道。因此本研究以小鼠为模型,探讨中心体蛋白CEP72在小鼠精子发生过程中的功能及机制,希望为男性不育候选基因及少精症、弱精症的临床诊疗和研究提供一定理论参考。方法:（1）RT-PCR在转录水平上检测Cep72在各组织中的表达情况。（2）使用原核表达系统制备CEP72多克隆兔抗,通过Western Blot在蛋白水平上进一步检测CEP72在各组织中的表达情况。（3）通过CRISPR-Cas9基因编辑技术制备Cep72全身性敲除小鼠,并在基因组水平和蛋白水平上验证敲除。（4）通过组织形态学分析探究Cep72敲除后小鼠生精能力是否受到影响。（5）通过PNA和DAPI共染探究Cep72敲除后小鼠精子形态是否受到影响。（6）通过电镜探究Cep72敲除后小鼠精子鞭毛结构是否受到影响。（7）通过精母细胞染色体铺展和核型分析实验探究Cep72敲除后小鼠减数分裂进程是否受到影响。（8）合笼交配统计产仔数量及生殖间隔时间以检测Cep72敲除小鼠的生育力。结果:（1）在转录水平上,Cep72在睾丸组织中高表达,其他组织中也有少量表达。（2）成功制备了CEP72多克隆兔抗,在蛋白水平上进一步证实了CEP72在生殖器官-睾丸中高表达。（3）在基因组水平和蛋白水平上验证成功制备了Cep72全身性敲除小鼠。（4）Cep72敲除后,小鼠睾丸形态及重量方面均无明显差异,HE染色结果显示小鼠生精小管形态正常,存在各级精母细胞,且附睾中精子数量和WT鼠相比也无显著性差异。（5）Cep72敲除小鼠精子头部的异常率显著增加。（6）Cep72敲除小鼠精子鞭毛异常率显著增加。（7）在Cep72敲除小鼠精母细胞减数分裂进程中,DNA双链断裂（DSB）形成、修复、染色体联会、同源重组和WT鼠相比没有差异。（8）Cep72敲除后小鼠的生育力并未受到影响。结论:Cep72敲除后会影响小鼠精子头部和鞭毛的正常组装,但不会损害小鼠生育能力,对精子发生不产生决定性影响。