黄瓜细菌性角斑病生防贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）物理诱变育种、抑菌机理初探及应用研究

作     者：刘世程 

作者单位：天津农学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李宝聚;Xie Xuewen

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：芽胞杆菌 诱变 ARTP 黄瓜细菌性角斑病 悬浮剂 

摘      要：黄瓜细菌性角斑病是由扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali ***)引起的病害。在我国保护地黄瓜中,该病发生面积和严重程度都在逐年扩大,危害着保护地黄瓜生产。生物防治已成为防治该病害的热点,天然微生物资源的遗传改造可进一步提升生物防治作用效果。本研究采用本课题组前期筛选到的一株防治黄瓜细菌性角斑病的生防贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZF145作为出发菌株,经紫外诱变和室温常压等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变技术进行遗传改造,结合全基因组测序和全基因组重测序技术对菌株的生防功能进行挖掘,对突变机理进行分析,开展了剂型加工和应用技术研究,为诱变菌株的产业化应用提供了理论依据。主要研究内容如下:(1)通过ARTP诱变获得一株高活性贝莱斯芽胞杆菌A561,防效提高21.83%。利用紫外和ARTP 2种方式进行诱变,分别获得诱变菌株1249株、663株。经纸碟法筛选,紫外诱变获得正突变菌株12株,失效菌株1株;ARTP诱变获得正突变菌株71株。利用纸碟法和活体盆栽试验对突变菌株进行筛选,获得一株对黄瓜细菌性角斑病防效显著提高的贝莱斯芽胞杆菌A561,对黄瓜细菌性角斑病防效为63.61%;获得一株失效贝莱斯芽胞杆菌U279,在离体和活体情况下对黄瓜细菌性角斑病均无防效。(2)通过全基因组测序分析,明确贝莱斯芽胞杆菌ZF145基因组大小为3929800bp,GC含量为46.5%,共有1条染色体;通过突变菌株重测序分析,在2株突变菌株中各存在1个非同义SNP,分别位于与生防相关的基因rfb B、deg S。菌株ZF145基因总数为3866个,其中编码基因3748个,存在Fengycin等8种次生代谢产物合成基因簇,具有丰富的生防潜力。在正突变菌株贝莱斯芽胞杆菌A561中发现1个非同义突变SNP,位于基因deg S,突变后可提高菌株定殖能力;在失效突变菌株贝莱斯芽胞杆菌U279的基因组检测到2个SNP,其中非同义突变发生于基因rfb B,该基因编码d TDP-葡萄糖脱水酶,突变后次生代谢产物合成前体的生成量减少,从而使抑菌活性丧失。(3)通过单因素试验与活体生测试验,确定发酵培养基组分为淀粉25 g/L,玉米粉25 g/L、豆粕粉40 g/L,NaHPO1 g/L,Na HPO1 g/L,最适起始p H=6.0,发酵温度28℃,发酵时间36 h。采用单因素试验确定了50%贝莱斯芽胞杆菌A561悬浮剂配方为贝莱斯芽胞杆菌A561发酵液50%,IVF-2 2%,IVF01 3%,黄原胶0.3%,硅酸镁铝0.5%,防腐剂苯甲酸钠0.10%,其余部分用水补足。经检测,该工艺制备的2.43×10CFU/m L贝莱斯芽胞杆菌A561悬浮剂各项指标均符合标准,可用于微生物菌剂的加工。