苹果MdPIP1;2基因在低温胁迫中的功能分析及其上游调控因子的鉴定

作     者：汪晶晶 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘晶莹

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：苹果 质膜水通道蛋白 低温胁迫 启动子 

摘      要：水通道蛋白（aquaporins,AQPs）是生物体内跨膜运输水分的通道蛋白,质膜水通道蛋白（Plasma membrane intrinsic protein,PIP）是最大的植物AQP亚家族,存在于细胞质膜上,广泛分布于各个组织器官中,在维持植物水分平衡和抵御逆境胁迫方面起到重要作用。本研究以异源表达MdPIP1;2转基因拟南芥和过表达MdPIP1;2苹果愈伤组织为材料,分析低温胁迫下MdPIP1;2基因的功能;克隆MdPIP1;2启动子序列,构建GUS重组表达载体,转化拟南芥和苹果愈伤组织观察MdPIP1;2启动子调控基因的组织特异性表达特征及其对低温胁迫的响应;经酵母单杂交筛选MdPIP1;2基因上游可能存在的转录调控因子并进行验证。获得的结果如下:1.异源表达MdPIP1;2转基因拟南芥能够提高植株的耐冷性。4℃低温条件下,转基因拟南芥种子萌发率和根长伸长量均显著高于野生型;12-18 d的幼苗和21-28 d的成苗分别经过-20℃低温胁迫1.5 h和2 h,其转基因株系成活率均显著高于野生型,转基因成苗的细胞膜损伤程度低于野生型。2.过表达MdPIP1;2基因能够提高苹果愈伤组织的耐冷性。4℃低温条件下,过表达MdPIP1;2转基因苹果愈伤组织的生长优于野生型,转基因愈伤的鲜重显著高于野生型。3.从‘秦冠’叶片基因组DNA中克隆获得MdPIP1;2基因编码区前1645 bp的启动子序列,通过对启动子序列的预测分析,发现其顺式作用元件主要包括:激素响应元件ABRE、CGTCA-motif、TGA-element;厌氧响应元件ARE;光响应元件G-BOX、chs-CMA1a、AE-BOX、Pc-CMA2c、GT1-motif、BOX 4、BOXⅡ;胁迫响应元件MBS、CBFHV等。将启动子截短为P1645、P940、P561、P204四个片段,分别构建pro MdPIP1;2-GUS重组表达载体,瞬时转化烟草,进行GUS组织化学染色,结果显示四个片段均能够驱动GUS报告基因转录表达,其中P561诱导表达的GUS活性最强,说明该片段可能是调控MdPIP1;2基因转录的核心区域。4.获得启动子稳定转化拟南芥T2代株系,挑选该株系不同生长阶段的样品进行染色,分析不同时期组织器官中MdPIP1;2启动子驱动的GUS表达情况。结果显示MdPIP1;2启动子驱动的GUS在根、茎、花等器官中大量表达,果荚和种子中也有少量表达;此外,各器官的顶端分生组织、叶片的毛状体等组织中可见GUS的大量表达。我们还通过遗传转化,获得含有MdPIP1;2启动子和GUS重组表达载体的转基因苹果愈伤组织,4℃低温条件下,处理组转基因苹果愈伤组织相比于对照组,GUS表达量显著提高,说明低温能够诱导上调MdPIP1;2启动子驱动的GUS表达。5.通过酵母单杂筛交获得了与MdPIP1;2启动子互作的转录因子,将其中的MdCBF-l1进行了回转验证,结果表明MdCBF-l1可以结合MdPIP1;2的启动子序列,同时上调MdPIP1;2基因的表达。