星形胶质细胞来源的EV-wnt1促进NSC增殖的作用及相关应用探索

作     者：陈兴民 

作者单位：电子科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨露

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：星形胶质细胞 Wnt1 Extracellular Vesicle 神经干细胞 

摘      要：在帕金森疾病的动物模型上,活化的星形胶质细胞被证明通过上调Wnt1的表达以激活神经干细胞(NSCs)Wnt/β-catenin信号通路,促进内源性神经再生及多巴胺神经元的修复。然而,Wnt1是如何在活化的细胞间传递的问题尚不明确,亟待探索。外泌体是一种具有磷脂双分子层的30-100nm的细胞外囊泡,近年来被证明为细胞间通讯的重要工具,也是mi RNA,蛋白及磷脂等功能性分子的重要载体。已有的研究表明,外泌体对信号分子的负载能力将有效促进这些分子对靶细胞的调控作用。该研究旨在证明星形胶质细胞表达的Wnt1配体通过外泌体参与对NSCs增殖的调控,并通过构建负载Wnt1蛋白且具有靶向NSCs作用的工程化外泌体,通过应用于内源性神经再生功能严重受损的帕金森疾病模型中,探索该工程化外泌体的应用价值。本项研究首先使用小鼠中脑来源的星形胶质细胞系IMA2.1细胞,通过构建和转染Wnt1过表达质粒,使IMA2.1细胞系稳定表达Wnt1蛋白,通过超速离心法富集IMA细胞培养上清液中的外泌体,通过电镜,Nano ZS粒度检测等方法,检测转染前后细胞分泌的外泌体数量、大小等物理特点,与对照组相比,来源于Wnt1过表达质粒转染的IMA细胞分泌的外泌体负载的Wnt1蛋白显著增加,而外泌体的数量及大小不受影响。我们通过western blot证明Wnt1蛋白富集于收集的外泌体上;我们使用小鼠原代NSCs,通过无接触的共培养模型及药理学实验证明外泌体参与了Wnt1在星形胶质细胞与NSCs间的传递;利用CCK8、细胞计数等方法检测发现EV-wnt1对NSCs的增殖具有明显的促进作用;通过western blot,免疫组化等实验证明,经EV-wnt1处理的NSCs胞内β-catenin转核显著上调,EV-wnt1激活了NSCs的经典Wnt/β-catenin通路,实现对细胞增殖的调控作用。最后通过构建具有靶向NSCs肽段的工程化外泌体EV-NFL-wnt1,在帕金森疾病细胞及整体实验模型上,通过Brd U标记等实验方法初步验证了通过EV-NFL-wnt1对神经毒性造成的神经干细胞的损伤有明显的保护作用。在后续的研究中,我们将进一步结合示踪技术,检测EV-NFL-wnt1的靶向特异性,为使用外泌体携带的促内源性神经再生的药物分子提供更详细的实验数据,为新型给药方式的遴选提供理论及实验基础。