AI-2通过调节c-di-GMP代谢酶DosC影响类志贺邻单胞菌生物膜形成及运动性

作     者：谢晓荣 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张磊

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：类志贺邻单胞菌 LuxS/AI-2 受体 c-di-GMP 生物膜 泳动 

摘      要：群体感应(Quorum Sensing,QS)信号分子Autoinducer-2(AI-2)在细菌中广泛分布,是细菌启动群体密度应答的分子之一。与大多数自诱导物不同,产AI-2信号的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌不仅能够调控自身的群体行为,也可以影响不能产生AI-2的细菌。当细胞达到高密度时,其激活的基因表达参与一系列生命活动,包括生物发光、运动、生物膜形成、抗逆、致病因子的产生等(Alencar et al.2021)。然而该信号分子对许多细菌生理功能的调控作用及其分子机制尚未有所报道。类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)是一种常见的致病菌,不仅对人类健康构成严重威胁,也对养殖业的生产带来极大的风险。本实验以类志贺邻单胞菌NCTC 10360(P.shigelloides NCTC 10360)为研究对象,旨在揭示AI-2通过影响其胞内环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)水平调控该菌生物膜形成及运动性的内在机制,为类志贺邻单胞菌感染的防治提供新思路。主要研究结果如下:1.首先利用同源重组方法构建类志贺邻单胞菌lux S基因敲除菌株,通过软琼脂平板法和结晶紫染色法分别检测其与野生型泳动能力和生物膜形成水平的差异,结果表明lux S基因的缺失会削弱其生物膜形成和泳动能力。2.通过序列比对找到AI-2的潜在受体蛋白Dos C(SAMEA2665130＿2180),利用哈维氏弧菌生物发光实验及等温滴定量热实验(ITC)分析Dos C的配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD)与AI-2的结合能力,结果显示AI-2与Dos C-LBD显示出高亲和作用力(K=2.83±0.17μmol/L)。3.膜蛋白Dos C除了含有周质配体结合结构域外,胞内部分还含有与c-di-GMP代谢相关的GGDEF和EAL串联结构域。通过表达纯化全长跨膜蛋白Dos C,在添加或不添加DPD/AI-2、提供反应底物和适宜反应条件下进行体外酶活实验,并利用高效液相色谱分析反应产物,结果显示AI-2会增强受体蛋白Dos C的磷酸二酯酶活性,促进c-di-GMP的降解。4.最后构建AI-2受体Dos C编码基因敲除菌株(Δdos C),提取并利用液质联用方法测定了类志贺邻单胞菌野生型、Δlux S、Δdos C菌株的胞内c-di-GMP含量,发现与野生型相比,Δlux S与Δdos C菌株的胞内c-di-GMP水平均有明显提高。最后对Δdos C与野生型泳动和生物膜形成能力进行测定,发现与野生型相比,Δdos C菌株的生物膜形成水平及泳动能力均有显著下降。这些结果表明AI-2通过Dos C调控胞内c-di-GMP水平,进而影响类志贺邻单胞菌的生物膜形成及泳动能力。以上结果表明,类志贺邻单胞菌NCTC 10360中胞内c-di-GMP水平的积累抑制其生物膜形成和泳动能力,c-di-GMP代谢酶Dos C通过响应群体感应信号分子AI-2,增强其自身的磷酸二酯酶活性,促进了c-di-GMP的降解,影响胞内c-di-GMP的含量,进而调控细菌的生物膜形成和泳动能力等表型。