重组漆酶OhLac的分子改造及其降解性能研究

作     者：张乐珊 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕欣

授予年度：2022年

学科分类：081703[工学-生物化工] 080703[工学-动力机械及工程] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0807[工学-动力工程及工程热物理] 

主      题：细菌漆酶 定向改造 木质素原料降解 染料脱色 

摘      要：利用生物方法(如细菌和酶类)降解木质素相比于物理化学方法具有耗能低、污染小等优势,漆酶作为一种清洁高效且环保的降解木质素的方法近年来深受热捧,越来越多的不同来源的漆酶从自然环境中分离筛选而获得。但是随着研究的深入,野生漆酶的活力并不能满足实际工业的需求。因此,利用生物技术对于野生漆酶进行改造,为其未来发展提供新的可能。本研究基于实验室前期构建的含有漆酶基因的重组工程菌,该工程菌所产漆酶OhLac具有产量高、适应性强等优势,但是仍存在重组漆酶“酶活低这一缺点。因此,本研究用理性设计方法来改造苍白杆菌(Ochrobactrum sp.J10)OhLac漆酶,构建重组突变菌株,以苯胺蓝板脱色能力为指标对诱导表达后的改性重组酶进行筛选,获取优势突变漆酶;分析优势突变漆酶的酶学特性及其突变催化机理,进一步研究突变漆酶的木质素原料降解能力以及染料脱色能力。主要研究结果如下:(1)通过同源建模和分子对接技术,在活性中心附近寻找可能影响酶促反应的关键氨基酸位点。同时结合优势漆酶氨基酸序列比对,最终对推测出七个位点、十个氨基酸进行定点突变,构建含有突变位点的目的基因,最终构建出27个突变菌株并在大肠杆菌中异源表达,通过粗酶液和纯化酶的两次苯胺蓝板脱色实验,最终筛选出Y179H、S187G、S187G-3三个潜力突变漆酶。(2)选取ABTS、2,6-DMP和愈创木酚三种底物对于突变漆酶性质进行测定。突变酶的最适温度处于50-70℃,最佳p H值处于3.0-5.0偏酸的环境中。低浓度的Cu环境中突变酶可以保持较高的酶活力,Fe对酶活表现出明显的抑制性。Y179H和S187G-3对于底物ABTS的最大反应速率和催化效率分别为16.03 U/mg,19.16 U/mg和8.27s,11.48 s较原始OhLac分别增加了1.32倍,1.58倍和1.33倍,1.85倍。S187G对于底物Gua的最大反应速率和催化效率分别提高了3.26倍和3.28倍。(3)突变酶对于碱木素的降解随着其浓度的增加,降解率减低。其中S187G表现出良好的降解能力,在碱木素最高浓度0.35 m M时,降解率仍可达到39.50%。而突变酶对于三种类型的木质纤维素原料的失重率均20%,而降解率(除玉米秸秆外)均10%,其中S187G-3对于小麦秸秆的失重率最高可达将近30%。同时电镜结果表明突变酶较原始OhLac对于秸秆表面的破坏程度更大,碎片化、分层化更加严重。(4)突变酶对于染料的脱色随时间的增减先增加后趋于平稳,脱色体系的最适p H值(4.0-5.0)和温度(40-50℃)与突变酶自身的最适条件较为一致。四种氧化还原介体的加入会不同程度的提高突变漆酶对于各染料的脱色效果。