肿瘤细胞中钙离子依赖的MT1-MMP转运的机制研究

作     者：孙瑞 

作者单位：云南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙建伟

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：MT1-MMP 钙离子 蛋白转运 

摘      要：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类蛋白质,它们的主要作用是降解细胞外基质。其中膜I型基质金属蛋白酶又称作跨膜基质金属蛋白酶(membrane type 1 matrix metalloproteinases,MT1-MMP)或MMP-14,其可以定位在细胞膜上,通过降解细胞膜外部的大分子化合物,促进细胞侵袭、迁移等行为。有研究表明以上的各种生理功能都是依靠钙离子依赖的MT1-MMP转运实现的。因此,为了确定MT1-MMP在细胞内的转运机制我们进行了靶向筛选,并开展了一系列机制研究。本研究通过分析阐述retromer介导MT1-MMP转移机制研究将会为肿瘤的治疗提供理论基础、策略和新的靶点。本研究获得主要结论如下:1、我们发现WM793(人黑色素瘤细胞)在被三磷酸肌醇受体(Inositol trisphosphate receptor,IP3R)抑制剂2-氨基醋酸二苯基硼酸(2-Aminoethyl diphenylborinate,2-APB)或者钙离子螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四(乙酸基甲基)酯(Tetrakis(acetoxymethyl)1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetate,BAPTA-AM)处理后,细胞内的MT1-MMP会聚集到核周区域,且2-APB与BAPTA-AM对MT1-MMP的作用是特异的。2、我们发现WM793细胞在用2-APB处理后,MT1-MMP的成熟形式蛋白会随着处理时间的增加而减少,并且非成熟形式不断增多;同时发现细胞膜上MT1-MMP成熟形式的蛋白含量减少,并且细胞内部出现了非成熟形式的MT1-MMP的累积。3、为了进一步研究清楚其中的机制,我们进行了基因筛选,最终筛选出胞内逆向转运复合物(retromer)组分分拣蛋白35(vacuolar protein sorting 35,VPS35)。我们发现VPS35可以和MT1-MMP形成复合物并协助其转运。在WM793与SW480(结直肠癌细胞)中敲降VPS35会使细胞膜上的MT1-MMP减少,这表明VPS35可能参与了MT1-MMP的调控。4、MT1-MMP主要被溶酶体分解。使用蛋白酶体抑制剂MG132与溶酶体抑制剂BFA1处理后,Western Blot结果显示,BFA1可以抑制MT1-MMP的降解,表明MT1-MMP在溶酶体中被降解。5、对照组、2-APB处理组和VPS35缺失组进行免疫荧光染色,发现钙离子不足和VPS35的缺失都会导致MT1-MMP与晚期内吞体的共定位程度增加,并在细胞核周围聚集。2-APB处理会导致MT1-MMP与VPS35和溶酶体的共定位程度下降。但缺失VPS35会使MT1-MMP与溶酶体共定位程度增加。综上所述,钙离子的不足和VPS35的缺失都会影响MT1-MMP的转运。但两者的原理不同。钙离子不足会影响MT1-MMP的成熟和向外运输,导致非成熟形式的MT1-MMP在胞内富集。而VPS35的缺失则会影响MT1-MMP的循环,并使过多的MT1-MMP通过溶酶体途径降解。本研究对研究黑色素瘤与结直肠癌的发生机制和临床治疗有重要的意义,并为抑制肿瘤转移提供了一种潜在的治疗策略。