霍氏肠杆菌噬菌体生物学特性及其在食品减菌中的应用研究

作     者：陈曹伟 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨振泉;刘恩歧;张辉

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：霍氏肠杆菌 噬菌体 生物学特性 基因组 生物控制 

摘      要：霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）是一种人兽共患病原菌,归属肠道菌群75。近年来研究显示全球已发生多起新生儿感染霍氏肠杆菌引发的败血症病例,霍氏肠杆菌危害逐渐引起人们重视。此外,抗生素滥用导致病原菌耐药性日益严重,霍氏肠杆菌分离株也呈现出多重耐药特征,包括对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等多种抗生素的抗性。建立霍氏肠杆菌快速检测和生物控制技术是控制其在食品链污染和传播的迫切需求。本研究利用分离自肉制品中的食源性霍氏肠杆菌分离株为宿主,分离筛选到6株霍氏肠杆菌烈性噬菌体,并系统研究了霍氏肠杆菌及其噬菌体的生物学特性、基因组特征,以及噬菌体生物控制剂的食品减菌应用潜力,为霍氏肠杆菌生物控制、特异性检测、以及生态学研究提供了噬菌体工具。具体研究结果如下:（1）从真空包装肉制品（涨袋样品）中分离获得1株霍氏肠杆菌（YZU05）并分析基因组特征和耐药性。16S rRNA测序结果表明菌株YZU05为霍氏肠杆菌（命名为Eh-YZU05）。全基因组测序结果显示,Eh-YZU05基因组全长4,701,521 bp,编码基因长度4,189,419 bp,GC含量为56.8%;基因组编码4358个蛋白质基因,包含955个细胞过程与信号相关基因、713个信息存储与处理相关基因、1890个新陈代谢有关基因,其中包括57个抗生素抗性基因和142个细菌毒力因子基因。耐药性测定结果显示新分离菌株Eh-YZU05对青霉素G、阿莫西林、红霉素、阿奇霉素、苯唑西林、万古霉素、呋喃妥因、新生霉素、林可霉素10种抗生素耐药,耐药种类明显高于来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏菌株 CICC 10432、CICC 23487 和 CICC 24133。（2）霍氏肠杆菌高效裂解性噬菌体的分离筛选及其生物学特征研究。应用噬菌体富集培养联合双层平板法从污水中分离获得6株霍氏肠杆菌烈性噬菌体,分别命名为 Ehp-YZU05、Ehp-YZU08、Ehp-YZU10、Ehp-YZU9-1、Ehp-YZU9-2和Ehp-YZU9-3。应用透射电镜形态学分析结果显示Ehp-YZU05和Ehp-YZU9-1属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）,Ehp-YZU08、Ehp-YZU10、Ehp-YZU9-2 和 Ehp-YZU9-3属于短尾噬菌体科（Podoviridae）。一步生长曲线显示6株噬菌体的宿主菌感染潜伏期在5-40min,裂解量为70-283 PFU/cell,其中噬菌体Ehp-YZU08和Ehp-YZU10显示了最短的潜伏期,噬菌体Ehp-YZU9-2显示了最高的裂解量。热稳定性和pH稳定性试验结果显示60℃温浴60 min和pH 5～10条件下所有噬菌体分离株均能保持稳定的裂解活性。（3）霍氏肠杆菌高效裂解性噬菌体的基因组特征分析。测定了 6株噬菌体的全基因组序列,全长在39,502-173,418 bp之间,编码基因占总基因的比例在86.9%-94.6%之间。6株噬菌体的已知功能基因注释包含噬菌体结构蛋白基因（如头部蛋白基因、尾部蛋白基因、衣壳蛋白基因等）、DNA复制基因（DNA聚合酶基因等）、噬菌体裂解基因（如内溶素酰胺酶基因、穿孔素基因等）。将本研究6株噬菌体和NCBI数据库的2株霍氏肠杆菌噬菌体基因组序列进行聚类分析,结果发现本研究中的噬菌体与已发表的2株噬菌体序列相似性低（无同源性）,表明本研究获得的是霍氏肠杆菌新型噬菌体。应用Blast将本研究中的噬菌体Ehp-YZU05、Ehp-YZU08、Ehp-YZU10 和 Ehp-YZU9-1 分别与 GenBank 数据库中同源性最高的噬菌体基因组序列进行比较基因组学分析,结果表明这4株噬菌体分别拥有118、13、13和257个基因片段与数据库中基因同源性≥90%,另有82、32、32和36个基因片段与数据库中基因没有同源性或90%。本研究中的所有噬菌体基因组中未发现有任何与细菌毒力或耐药性相关的基因。此外,6株噬菌体基因组中含有23～110个复制相关基因,可能与噬菌体潜伏期和裂解量差异相关。（4）利用培养基和肉汁模拟污染模型研究了噬菌体在减除食品中霍氏肠杆菌中的应用潜力。试验结果表明6株噬菌体对霍氏肠杆菌均显示较强的抑制能力,在37℃恒温培养过程中,噬菌体Ehp-YZU08、Ehp-YZU10、Ehp-YZU9-1和Ehp-YZU9-2随着处理浓度升高,最大减菌率（Rmax）相应提高,达到最大减菌率的时间（Tmax）相应缩短;其中,噬菌体Ehp-YZU05和Ehp-YZU9-3在MOI=0.1的浓度下显示了最高的Rmax和Rfinal。在MOI=0.1的浓度下,噬菌体Ehp-YZU9-3最大减菌率为5.48 Log CFU/mL,最终减菌率为4.50 Log CFU/mL,对霍氏肠杆菌的抑制作用最好。肉汁模拟污染模型结果显示6株噬菌体在2h内的滴度增长幅度均较小,2h后增长加快,4-6h后达到最大滴度。噬菌体的初始剂量越小,噬菌体越能获得最有效的增殖并产生最大数量的子代噬菌体。测定了噬菌体 Eh-YZU05、Eh-YZU08、Eh-YZU10 和 Eh-YZU9-1 的不敏感突变频率和不敏感突变特性,结果显示霍氏肠杆菌对四株噬菌体不敏感突变频率在2×10-6～3.6×10-5之间,其中噬菌体Ehp-YZU10的抗性突变频率最低（2×10-6）,对噬菌体Ehp-YZU05、Ehp-YZU08和Ehp-YZU9-1的抗性突变频率分别为1.1×10-5,3.6×10-5,和1.9×10-5,表明四株噬菌体处理均可引起霍氏肠杆菌的不敏感突变,但频率相对较低,有利于作为生物控制剂的开发应用。对霍氏肠杆菌噬菌体不敏感突变株的耐热性进行分析,结果显示在55℃下,敏感菌株温浴35 min达到不可检测水平,而所有不敏感突变株温浴20～30 min即达到不可检测水平,表明突变后菌株耐热性出现不同程度下降。不敏感突变株在37℃恒温培养平板上形成的菌落变小,存在营养缺陷和生长繁殖能力下降特征,表明霍氏肠杆菌在噬菌体减菌处理后形成的抗性菌株的生长和抗逆能力均显著下降,对常规热杀菌条件更加敏感。