LncRNA-Snhg1通过PTEN/AKT/c-Myc促进心脏再生
作者单位：南方医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：宾建平
授予年度：2019年
主 题：LncRNA-Snhg1 心肌增殖 心肌梗死 心肌再生 AKT
摘 要：研究背景和目的实现心肌细胞的有效再生是治疗终末期心脏疾病亟待解决的问题。乳鼠心肌细胞仍然保留一定的心肌再生能力而成年人心肌细胞几乎丧失该能力。探索该转变过程中随之改变的调节性基因,将可能发现心脏再生的潜在基因调控靶点。既往研究发现:lncRNA-Snhg1（Long noncoding RNA-small nucleolar RNA host gene1）能促进细胞增殖,与众多调节细胞周期的基因的表达相关;我们通过比较不同鼠龄的小鼠的心脏组织发现,随着心脏再生能力减弱lncRNA-Snhg1的表达水平也逐渐降低。因此,我们猜想lncRNA-Snhg1可能参与了心肌细胞增殖乃至心脏再生的调控过程。本项目拟:1.检测lncRNA-Snhg1的基础表达情况和进行亚细胞定位;2.通过功能获得/缺失来探索lncRNA-Snhg1是否在体内外参与心肌细胞增殖;3.探索lncRNA-Snhg1对心梗后心肌再生的作用从而实现心功能的有效恢复;4.阐明lncRNA-Snhg1的分子调控机制。该项目筛出或能有效促进心肌再生潜在的基因,为治疗心衰提供新的治疗靶点。材料与方法1.主要实验材料1.1实验动物C57BL/6J胎鼠（16.5天龄）,新生小鼠（1天、3天、7天、14天龄）,成年小鼠（42天龄）。本实验中所有的操作均有严格按美国国立卫生院（National Institutes of Health,NIH）“the guide for the care and use of Laboratory animals的规定执行。本课题实验动物由南方医科大学的实验动物中心所提供且本校的实验动物委员会批准。1.2主要设备超净细胞培养工作台、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜、罗氏480 RT-PCR机、冰冻切片机、小动物超声等。1.3主要实验试剂EdU检测试剂盒、小鼠cTnT一抗抗体、兔pH3一抗抗体、山羊抗小鼠Alexa Fluor 488荧光二抗抗体、山羊抗兔Alexa Fluor 594荧光二抗抗体等。2.实验方案2.1探索lncRNA-Snhg1的基础表达情况（1）比较乳鼠心脏和成年鼠心脏lncRNA-Snhg1的表达谱差异。（2）探索lncRNA-Snhg1在心梗后表达变化情况。（3）比较lncRNA-Snhg1在不同组织、细胞的表达谱差异及其亚细胞定位。2.2体内外实验验证lncRNA-Snhg1能否促进心肌细胞增殖（1）明确敲低lncRNA-Snhg1对体外乳鼠心肌细胞增殖的影响。（2）明确过表达lncRNA-Snhg1对体内外成年心肌细胞增殖的影响。.2.3探索lncRNA-Snhg1能否促进心肌梗死（MI）后的心肌修复和再生（1）探索过表达lncRNA-Snhg1对MI模型小鼠心脏功能的影响。（2）明确过表达lncRNA-Snhg1对MI模型小鼠心肌细胞增殖的影响。2.4探索lncRNA-Snhg1下游作用分子及参与的信号转导通路（1）通过RNA Pulldown及蛋白质谱检测并发现lncRNA-Snhg1结合蛋白PTEN。（2）验证 lncRNA-Snhg1 对 PTEN/AKT/c-Myc 通路的影响。（3）探索PTEN/AKT/c-Myc是否参与lncRNA-Snhg1引起的心肌细胞增殖。2.5探索lncRNA-Snhg1上游作用分子（1）通过DNA Pulldown及蛋白质谱检测并发现lncRNA-Snhg1结合蛋白c-Myc。（2）验证 c-Myc 对 lncRNA-Snhg1/PTEN/AKT 通路的影响。（3）探索c-Myc是否参与lncRNA-Snhg1引起的心肌细胞增殖。结果1.LncRNA-Snhg1在乳鼠心脏中高表达并且主要表达在心肌细胞的细胞质中,随鼠龄的增加,LncRNA-Snhg1的表达水平逐渐降低。虽然LncRNA-Snhg1在成年鼠心脏中表达较低,但是心梗后LncRNA-Snhg1表达量会显著增加且主要表达在心梗交界区和心梗区。2.LncRNA-Snhg1过表达促进成年小鼠体内外心肌细胞增殖,敲低lncRNA-Snhg1抑制乳鼠体内外心肌细胞增殖。3.LncRNA-Snhg1促进成年小鼠心肌梗死后的心肌增殖,改善心功能。4.LncRNA-Snhg1通过PTEN/AKT/通路,促进心肌细胞的增殖。5.LncRNA-Snhg1被转录因子c-Myc激活,并发挥功能。结论LncRNA-Snhg1能通过PTEN/AKT/c-Myc,促进心肌细胞的有效增殖,并能够促进心肌梗死后心脏的修复和心肌再生,改善心脏功能。
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