原代与永生化犬脂肪间充质干细胞系对糖尿病疗效对比及安全性评估

作     者：程薛迪 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：华进联;孙亚东

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：脂肪间充质干细胞 永生化细胞系 犬 糖尿病 

摘      要：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是伴侣动物中常见的代谢性内分泌疾病之一,多发生在中、老龄犬中。其发生的原因与肥胖、免疫、药物、胰腺炎和环境因素相关,典型的临床症状包括多饮、多食、多尿和体重降低等。目前的治疗手段包括注射胰岛素或将干细胞诱导成为胰岛素分泌型细胞以恢复胰岛功能,但这些方法仍存在成本高昂或难以规模化制备的问题,故而在宠物临床糖尿病治疗中,迫切需要一种价格低廉且方便有效的治疗方法来解决如今的困惑。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)由中胚层发育而来,具有自我更新和多向分化潜力以及归巢能力,同时ADSCs还具有低免疫原性的特征,且相对容易从体内分离进行离体培养、扩增,与骨髓、脐带血、牙髓等来源的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)相比,ADSCs在多种疾病研究中表现出极强的取材优势和治疗潜力,因此,ADSCs的应用对细胞移植治疗的发展产生了巨大的推动作用。尽管ADSCs来源丰富,免疫原性低,但也存在着诸多问题,如分离步骤繁琐、易污染、供体差异、代次差异、细胞衰老等,这些都严重影响细胞治疗疾病时发挥的作用及其广泛应用。永生化细胞是一类稳定均一、性状一致且具有无限增殖能力的细胞,是一种可以替代原代细胞进行疾病治疗的新兴种子细胞。目前为止,关于永生化细胞系对疾病的治疗效果报道尚少。此前,本课题组成功建立了永生化犬ADSCs(Immortalized-Canine Mesenchymal Stem Cells,I-cADSCs)的细胞系,基于此,本研究以小鼠和犬为对象建立了糖尿病疾病模型,并使用原代犬ADSCs(Canine Mesenchymal Stem Cells,cADSCs)和永生化犬 ADSCs 对实验动物进行静脉移植,以探究原代与永生化犬ADSCs在糖尿病中的治疗效果,并对比不同细胞系的差异,以期选择合适的细胞及剂型,进行有效性和安全性评价,为宠物临床应用奠定基础。本研究中,我们将cADSCs与I-cADSCs在体外进行复苏和传代培养,后通过静脉移植至DM模型动物体内。昆白(KunMing,KM)小鼠共24只及中华田园犬8只,随机分为4组:正常对照组、DM组、cADSCs细胞治疗组、I-cADSCs细胞治疗组。除对照组外,其余3个试验组分别利用高脂饲喂联合链脉佐菌素(Streptozocin,STZ)建立DM模型,对照组则使用正常饲料饲喂并接受等剂量柠檬酸钠缓冲液注射。模型建立后第0天、第7天、第14天分别进行细胞移植(小鼠采用尾静脉单剂量注射,犬采用头静脉单剂量注射),正常对照组及DM组动物接受等量生理盐水注射。另选取18只KM小鼠和3只犬进行安全性评价。对实验动物的血糖、生化指标和病理组织进行检测,得到以下结果:(1)模型评价:连续腹腔注射STZ后,小鼠与犬血糖升高,体重减轻,精神萎靡,随机血糖大于11.1 mmol/L满足DM的标准,DM模型小鼠及犬肝脏和胰腺组织有明显的损伤特征,表明成功建立了DM模型。小鼠模型成功率为86.7%,犬模型成功率100%。(2)疗效评价:对比各项数据,ADSCs移植后,小鼠与犬血糖均降低,小鼠葡萄糖耐量与胰岛素耐量显著恢复,生化指标有所改善,小鼠和犬的组织损伤明显减轻。cADSCs对血糖的调控能力显著优于I-cADSCs。对于组织结构修复和生化指标的调节能力,两种细胞作用相当。结果显示,虽然I-cADSCs增殖速度快、批次稳定、能无限传代,但其在治疗糖尿病的过程中对血糖调节能力较原代细胞效果差,对于组织损伤修复与生化指标调节能力与cADSCs相差不大,证明静脉输注两种细胞系均有不同程度的疗效。(3)安全性评价:本研究对比了 cADSCs与I-cADSCs的安全性,通过在第0天、第7天和第14天对正常小鼠和犬静脉输注cADSCs和I-cADSCs,获取小鼠肝脏、胰腺和腹股沟脂肪进行组织学检测,结果显示组织形态均正常。检测犬的各项生化指标后未见明显异常,小鼠与犬均安全存活,存活率100%,表明静脉输注两种细胞系均为安全的。本研究证明了永生化ADSCs具备更强的稳定传代和明显的生长、增殖能力,通过使用cADSCs与I-cADSCs治疗DM动物模型,cADSCs显示出对DM更强的血糖调节能力,而I-cADSCs对组织修复和生化指标的恢复与cADSCs作用相当。此外,本研究证明了两种细胞系均是安全的。本研究为永生化cADSCs用于临床犬DM治疗提供了效果判定和安全性检测,为永生化ADSCs的广泛应用提供了一定的试验依据和应用基础。