黄连碱在糖尿病大鼠体内的排泄特性及其机制初探

作     者：陈红影 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张玉杰

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄连碱 药物代谢 排泄 糖尿病 血浆药动学 转运体 LC-MS/MS 

摘      要：黄连及其主要生物碱成分对治疗糖尿病有明显的疗效。研究发现,与正常大鼠相比较,黄连生物碱在糖尿病模型大鼠体内的生物利用度显著提高,而其作用机制尚未完全明了。由于药物的血药浓度与吸收、分布、代谢、排泄(ADME)四个过程密切相关,而ADME各环节往往需要体内广泛分布的转运体以及代谢酶的参与,因此转运体和代谢酶的功能是影响药物的生物利用度的重要因素。近期研究发现,病理状态可能会使转运体功能发生明显的改变,这种改变会使药物体内药动学受到显著的影响,严重时会导致疗效增强或产生药物毒副作用。由于黄连生物碱在体内主要是以阳离子形式存在的,其在体内的排泄过程与脏、肠道、胆管等排泄器官上广泛分布于部位转运体密切相关,由此我们推测,糖尿病病理状态可能造成了参与药物排泄的转运体功能的改变,使其排泄受到影响,导致黄连生物碱排泄量减少,进而使其血浆生物利用度显著增加。鉴于此,本课题采用糖尿病大鼠模型,以黄连碱作为黄连生物碱的模型药物,首先采用HPLC-MS/MS对黄连碱体内代谢产物进行鉴定,然后采用LC-MS/MS定量检测灌胃给药后收集的不同时间段的生物样品尿液、粪便、胆汁中原型及代谢物,探讨黄连碱在大鼠体内的排泄特性;在此基础上,采取股静脉单独给药或合用药和转运体抑制剂,比较黄连碱血药浓度的差异,确认介导黄连碱体内转运的主要转运体,以及这些转运体在糖尿病状态下的改变。完善黄连生物碱体内药动学特性,为其临床合理用药提供理论和实验依据。为此,本课题在已有研究基础上结合药动学研究的新技术和新方法,开展了以下几方面探索研究。1黄连碱在大鼠体内生物样品中原型及代谢物的鉴定制备STZ糖尿病大鼠模型,对正常及糖尿病模型大鼠称重后按20mg/kg低剂量、40mg/kg高剂量单次灌胃黄连碱,分别收集给药后0-48h的尿液和粪便以及0-36h的胆汁生物样品,在正离子模式下对处理后的生物样品进行高分辨LC-MS/MS质谱分析,对生物样品中的原型及代谢物进行鉴定。定性研究表明,黄连碱在尿液、粪便、胆汁共发现14个代谢产物,通过LC-MS/MS方法进一步分析,鉴定出尿液10个、粪便11个、胆汁中8个代谢产物。其可能发生的代谢途径主要有羟基化、去甲基化、脱氢(I相代谢)和葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化(Ⅱ相代谢)。探讨并推测得出黄连碱在正常及糖尿病大鼠中的主要代谢途径以及可能的代谢转化方式。2 LC-MS/MS定量分析方法的建立制备糖尿病大鼠模型,建立了灵敏、准确、可靠的尿液、粪便、胆汁等体内生物样品的LC-MS/MS定量分析方法。以小檗碱为内标,采用乙腈沉淀蛋白、超声提取、高速离心方法处理生物样品,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,用Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)分离,采用多反应监测(MRM)检测模式,于正离子模式对收集的体内生物样品尿液、粪便、胆汁中黄连碱及其代谢物建立定量或半定量检测,经方法学考察,专属性、精密度、检测限、准确度和稳定性等均符合生物样品分析要求。3黄连碱及其代谢物经大鼠尿液、粪便、胆汁排泄特性研究制备糖尿病模型大鼠,根据给灌胃药剂量分为低剂量(20 mg/kg)和高剂量(40 mg/kg)通过LC-MS/MS方法进一步分析,对生物样品中的原型进行定量以及尿液10个、粪便11个、胆汁中8个代谢产进行半定量分析。探讨了黄连碱在正常及糖尿病模型大鼠不同时间段在尿液、粪便、胆汁中原型及代谢物的排泄量以及累计排泄率。正常大鼠低剂量组黄连碱总的排泄率为14.29%,其中原型排泄量占到10.61%,代谢物的排泄量占到3.68%。并且原型药物粪便排泄占到9.67%,尿液的排泄占到0.94%,胆汁排泄量较少,占到0.85×104%;正常大鼠高剂量组黄连碱总的排泄率为19.36%,其中原型排泄量占到11.8%,代谢物的排泄量占到7.56%,并且原型药物粪便排泄占到9.15%,尿液的排泄占到2.65%,胆汁排泄量较少,占到0.76×10-4%。糖尿病大鼠低剂量组黄连碱总的排泄率为11.78%,其中原型排泄量占到9.11%,代谢物的排泄量占到2.67%,并且原型药物粪便排泄占到8.69%,尿液的排泄占到0.42%,胆汁排泄量较少,占到2.4×10-4%。糖尿病大鼠高剂量组黄连碱总的排泄率为12.28%,其中原型排泄量占到8.43%,代谢物的排泄量占到3.85%,并且原型药物粪便排泄占到7.68%,尿液的排泄占到0.75%,胆汁排泄量较少,为0.68×10-4%。由此推断黄连碱的主要排泄途径是以原型的形式通过粪便排泄,该结论为黄连碱的体内药动学及临床给药研究提供了参考。同时,与正常大鼠比较,黄连碱在糖尿病大鼠体内的排泄率有明显的降低,表明排泄是影响黄连碱生物利用度升高的一个重要因素。4影响黄连碱排泄机制初探根据给药方式将正常以及糖尿病模型大鼠均分为