PLCL1通过NLRP3炎症小体调控类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的炎症反应

作     者：罗帅 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李俊

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：类风湿性关节炎 磷脂酶C样蛋白1 成纤维样滑膜细胞 细胞因子 NLRP3炎症小体 

摘      要：类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)作为一种系统性、慢性、自身免疫性、炎症性疾病,以对称的方式影响大小滑膜关节。RA以关节的疼痛开始,炎性细胞逐渐侵蚀、破坏关节,进一步恶化关节的状态会对关节造成永久性不可逆的损伤,最终致畸致残。在全球大约有120万例风湿性关节炎病例。尽管有各种各样的治疗方法和药物对抗类风湿性关节炎,但没有一种方式能保证完全治愈。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocyte,FLS)是关节中的内衬细胞,他表观遗传的变化使其具有侵袭性,并在RA病理过程中起重要作用。在RA中,FLS产生致病介质,比如促进疾病发病的细胞因子和蛋白酶。参与病理机制的趋化因子会募集体内的免疫细胞至滑膜处,如巨噬细胞、中性粒细胞、Th细胞还有B细胞。炎症因子在滑膜腔内与各种原始细胞相互作用,形成了慢性炎症循环,加重疾病的进程。本课题基于炎症免疫性疾病安徽省实验室之前的GWAS测序,对其筛选的五个RA易感位点进行进一步分析,分别是IL12RB2、PLCL1、CCR2、TCF7和IQGAP1。骨关节炎(osteoarthritis,OA)病人的滑膜组织为本实验的对照组,发现在RA病人的滑膜组织中磷脂酶C样蛋白1(Phospholipase C-Like 1,PLCL1)的m RNA表达上升且最明显。PLCL1富含于具有增殖能力的细胞中,具有调控脂质代谢,促进炎症反应作用。本研究预实验表明,PLCL1在RA组织中呈高表达,提示PLCL1可能参与RA的病理机制,对此本课题对PLCL1进行的初步探究,结果如下:1.PLCL1在K/BxN小鼠中表达升高本课题选择了自发性关节炎模型K/BxN小鼠,以其父系KRN小鼠为对照收集它们的踝关节。通过HE染色鉴定K/BxN小鼠造模是否成功。同时,用IHC染色检测PLCL1蛋白在K/BxN小鼠滑膜组织中的表达,结果表明PLCL1在在K/BxN小鼠中高表达。2.PLCL1在RA中高表达本课题收集了OA病人和RA病人的滑膜组织。通过HE染色鉴定其病理变化,也用IHC检测了PLCL1在RA滑膜组织中的表达。提取原代RA FLS后,用RT-qPCR的方式从IL-1β,IL-6,CXCL8,IL-17A,TNF-α,IFN-γ和LPS中筛选出用TNF-α刺激FLS的方式。通过RT-qPCR和WB检测0 ng/m L,1.25 ng/m L,2.5 ng/m L,5 ng/m L,10 ng/m L和20 ng/m L 5个浓度TNF-α的刺激效果,最终选择用10ng/m L的TNF-α刺激FLS来模拟RA的体内慢性炎症环境。最后用IF双染检测TNF-α刺激前后的FLS中的PLCL1和Vimentin蛋白。验证10ng/m L TNF-α刺激FLS中PLCL1上调3.PLCL1促进RA FLS的炎症反应采用PLCL1-RNAi特异性沉默RA FLS中PLCL1的表达,WB检测PLCL1的表达在沉默后显著下调。进一步使用RT-qPCR、WB和Elisa的方式检测FLS的炎症反应。结果表明沉默PLCL1能抑制IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA和蛋白的表达,但是并不能完全抵消;而使用PLCL1-pc DNA3.0在RA FLS中过表达PLCL1后,IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA和蛋白的表达显著提高。4.探究PLCL1影响FLS炎症反应的机制本课题在沉默PLCL1的同时,发现FLS中NLRP3和Cleaved-Caspase-1的表达也随之降低,酶联法检测出FLS上清中IL-1β的水平也显著下调;用PLCL1-pc DNA3.0过表达PLCL1后,FLS中的NLRP3和Cleaved-Caspase-1的表达随之升高,酶联法检测FLS上清中IL-1β的水平也显著上调。而在用PLCL1-pc DNA3.0上调PLCL1的同时滴加NLRP3炎症小体通路特异性抑制剂INF39,WB结果表明NLRP3、IL-1β、IL-6和Cleaved-Caspase-1的表达被抑制。综上,本课题的结果提示PLCL1由经NLRP3炎症小体信号通路介导RA FLS的炎症反应的可能性。