Study on the Recombinant Expression and Purification of A Fusion Protein ACTH-TPAST-IGFI in ***

作     者：ANUM MEHMOOD 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王大勇

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：促肾上腺皮质激素 促肾上腺皮质激素持久 基因工程 稳定性 药理作用制备 纯化 

摘      要：目的:胰岛素样生长因子(IGFs)是DNA序列与胰岛素非常相似的蛋白质。IGF是细胞用来与周围环境通讯的复杂系统的一部分,它们在促进细胞增殖和抑制细胞死亡或凋亡方面发挥着作用。研究表明,胰岛素/IGF轴在衰老中起着重要作用,在诸如癌症和糖尿病等疾病中也起着重要作用,例如,IGF-1既可以刺激前列腺癌细胞也可以刺激乳腺癌细胞生长。方法:在大肠杆菌中表达与组织纤溶酶原激活剂(TPAST)融合至胰岛素样生长因子(IGF1)的重组腺皮质激素(ACTH)重组融合蛋白(His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21)。并使用Ni-NTA琼脂糖珠进行纯化。IGF1通过TPAST底物接头与ACTH融合的原因是因为在血液中存在组织纤溶酶原激活剂(TPAST),它将作用于TPAST底物接头并切割该部位以释放ACTH和IGF1。IGFI可以使ACTH的效果提高20倍以上。(1)使用Primer Express软件设计wt ACTH,TPAst,IGF1的引物F和R。(2)使用蛋白酶数据库分析了ACTH中的蛋白酶(存在于血液中)的切割位点,并通过重叠PCR方法创建了融合ACTH-IPAst-IGF1的三个基因。(3)接下来,通过使用限制酶消化物连接到p ET21a载体中,构建融合表达质粒(His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21)。(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3菌株中进行蛋白表达。(5)在分析ACTH-TPAst-IGF1融合的重组蛋白的表达是否在上清液或沉淀级分中后,使用Ni-NTA琼脂糖珠进一步纯化。(6)由于蛋白质在大肠杆菌的沉淀级分中表达,因此由于形成包涵体而使其变性和微粒化。因此,需要对其进行复性和溶解以使其重折叠以增加活性。(7)下一步是在基于体外细胞的测定和体内测定中测试该蛋白的功能。结果:(1)通过重叠PCR产生融合的基因产物,然后亚克隆到p ET21a载体中。(2)构建野生型(WT)ACTH-TPAST-IGFI的质粒,然后通过DNA测序进行验证:(3)从大肠杆菌菌株BL21-DE3中表达并纯化以上所有物质。在SDS-PAGE凝胶上进行了考马斯亮蓝染色,显示了14kd融合蛋白在IPTG诱导培养物的沉淀级分和蛋白质纯化级分后的洗脱级分中的表达。(4)但是,由于蛋白质不溶,因此将其透析并重新折叠并浓缩蛋白质。(1)分子实验结果1.质粒图谱2.双重酶促裂解3.将融合基因PCR产物克隆到载体中***测序5.重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达6.蛋白质纯化和洗脱蛋白的复性。***-PAGE。凝胶用可可蓝染色。***法测定小鼠中c AMP,CREB和Gluco皮质类固醇浓度的产生(由于Covid-19的当前情况,有待完成)结论:(1)我们成功地在大肠杆菌中以沉淀级分克隆并表达了重组融合蛋白。(2)使用Ni-NTA磁珠对该14KD蛋白进行蛋白纯化得到纯洗脱级分,纯蛋白浓度为＿(3)我们成功地通过透析使14kd融合蛋白的蛋白复性。