联合应激诱导斑马鱼创伤后应激障碍模型的优化及氟代柠檬酸干预作用研究

作     者：王靖涛 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：Allan Kaluev

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100205[医学-精神病与精神卫生学] 10[医学] 

主      题：PTSD 氟代柠檬酸 炎症反应 细胞凋亡 

摘      要：创伤后应激障碍(Posttraumatic Stress Disorder,PTSD),是一种个体因为经历了强烈的创伤事件,致使内心无法承受而导致的一种精神障碍,但是其具体的病理机制尚不明确,现有药物的治疗效果也并不理想,同时文献报道中PTSD动物模型建立的方法并不统一,还存在诱导率低等问题。所以开发快速有效的建立PTSD动物模型的方法可以更好的探究其病理机制,寻找新的潜在治疗策略。斑马鱼是一种常被用于多种疾病研究的模式动物,且斑马鱼与人类基因同源性高达85%,因此逐渐成为了一种重要的药理学模型。PTSD发病机制复杂,研究表明神经炎症在PTSD的发生进展中发挥关键作用,创伤应激会导致星形胶质细胞的过度激活,大量释放炎症因子,如白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α等,促进炎症发生,诱导神经细胞凋亡,促进PTSD的发生发展。因此,抑制神经炎症可能是治疗PTSD症状的潜在策略。而氟代柠檬酸可以有效的抑制星形胶质细胞能量代谢,同时抑制星形胶质细胞释放炎症因子,具有一定的抗炎作用。因此,本课题通过联合应激法建立斑马鱼PTSD动物模型,通过斑马鱼行为学和生理学的变化,探究氟代柠檬酸对PTSD的干预作用。研究目的:通过联合应激法诱导斑马鱼PTSD模型,并探究氟代柠檬酸对PTSD症状的改善作用及潜在机制。研究方法:1)采用联合应激法(低温刺激+强光刺激+强迫游泳同时应激30min,浅水暴露30min,束缚应激30min)诱导斑马鱼PTSD模型,并通过新鱼缸测试、明暗箱测试、浅滩测试、旷野实验和镜子暴露实验等行为实验,评估斑马鱼在应激前后行为变化,酶联免疫吸附(ELISA)法检测斑马鱼应激前后皮质醇含量的变化,并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测炎症因子、早期即刻基因的表达,评估神经炎症相关指标的变化,苏木精—伊红染色法(HE染色法)和尼氏染色观察斑马鱼脑中细胞形态和尼氏体数量,评估神经细胞凋亡的情况;2)基于对PTSD模型的评估结果,用0.6 nmol/m L的氟代柠檬酸对PTSD斑马鱼进行为期7天,每天20 min浸泡给药的方式干预治疗,通过新鱼缸测试、明暗箱测试、浅滩测试观察斑马鱼行为模式的变化,实时荧光定量PCR检测鱼脑中星形胶质细胞标志物、炎症因子、神经营养因子、凋亡基因的表达,ELISA法检测斑马鱼体内全身炎症标志物含量,TUNEL荧光染色判断斑马鱼脑中神经细胞凋亡情况以及透射电镜观察斑马鱼脑细胞形态,探究氟代柠檬酸究氟代柠檬酸对PTSD症状的改善作用及潜在机制。研究结果:行为学实验结果表明,暴露于急性联合应激后的斑马鱼出现了明显PTSD样行为,具体表现为探索次数减少25%、停留在暗箱中的平均时间增加21%、个体间距增加53%、游动速度和移动距离分别减少23%和28%,以及攻击性行为时间增加27%。上述斑马鱼行为特征与PTSD动物行为特征一致。皮质醇水平检测结果表明,应激组斑马鱼体内皮质醇含量显著低于对照组,这一结果与啮齿类动物PTSD模型及人类患者的检测结果一致。以上行为和生理结果均表明该方法可以成功建立斑马鱼PTSD模型。鱼脑中基因检测结果表明,应激组斑马鱼脑中IL-1β,IL-6,即刻早期基因(C-jun,C-fos,egr-1)水平显著上调,表明PTSD斑马鱼在初期已经表现出明显的炎症反应。HE染色结果显示斑马鱼中脑区域的细胞核数量减少,细胞形态逐渐扭曲,脑组织中有明显的碎裂和空泡化病变;尼氏染色结果显示,斑马鱼脑组织中尼氏体数量减少,存在溶解、消失和粘连成团的状态。以上结果都表明应激组斑马鱼脑组织中存在神经细胞凋亡现象。氟代柠檬酸可以显著性的改善应激组斑马鱼的PTSD样行为,增加探索次数和时间,鱼群内个体间距恢复正常。氟代柠檬酸可显著抑制PTSD斑马鱼脑中炎症因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10)、星形胶质细胞标志物(GFAP、C3、C4B、EMP-1、S100-10)、凋亡基因(Bax、Bcl-2、Caspase-3)和BDNF及其受体基因(P75、Trk B)的表达,并促进炎症标志物一氧化氮(NO),一氧化氮合成酶(NOS)和血清淀粉样蛋白A(SAA)上调。凋亡染色和形态学观察发现神经细胞凋亡率显著降低,神经细胞肿胀、破碎等病理特征明显改善。表明氟代柠檬酸具有改善斑马鱼PTSD样行为,抑制炎症反应的发展,减少神经细胞凋亡的作用。结论:本次研究表明联合应激法可以成功诱导斑马鱼PTSD模型,并发现氟代柠檬酸可以通过抑制星形胶质细胞的过度激活,减少炎症因子的释放,抑制炎症反应的加剧,缓解神经细胞凋亡,对PTSD症状具有改善作用。提示抑制神经炎症可能是改善PTSD的关键机制,氟代柠檬酸对PTSD可能具有潜在的治疗作用。