光-酶催化体系构建及其在手性催化合成（R）-1-[3,5-二（三氟甲基）]苯乙醇中的应用

作     者：尹友程 

作者单位：杭州师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢恬;王安明;王淑玲

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：非天然氨基酸 交联酶聚集体 NADPH再生 二氧化钛光催化 光-酶催化体系 阿瑞匹坦 (R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇 不对称加氢 

摘      要：化学疗法是治疗癌症的常用方法,恶心和呕吐也是该疗法常见的副作用。阿瑞匹坦作为一种NK-1(Neurokinin-1)受体拮抗剂目前在临床上通过与多种方式的联合用药被广泛用于预防恶心和呕吐中,其中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇正是阿瑞匹坦合成的关键手性中间体,但是即便是反应条件温和、选择性高和可持续性强的生物催化,也一直被酶的固定化和昂贵的辅因子NADPH再生所制约,如:固定化中通常的化学固定化常因化学连接的盲目性和随机性致酶活性中心破坏和活性大幅下降;NADPH再生中常使用三乙醇胺或葡萄糖为氢供体,增加了下游过程的复杂性和成本,且可持续性有待提高。首先,为克服传统共价固定化中存在的问题,本文通过非天然氨基酸掺入修饰酶蛋白,表达制备携有生物正交化学反应基团的酶蛋白。为此,将具有催化逆向反应能力的乙醇脱氢酶(ADH)用作模板酶,并将156Y、208Q、229Y分别替换为对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(p-Pa F)。接着对野生型,突变过后的单点、双点突变型表达得到的酶蛋白均进行了酶学性质的测定。野生型的表达量为20mg·L,酶活力为0.185 U·mg;而单点突变型的表达量为18 mg·L,酶活力为0.174 U·mg;双点突变型的表达量为8 mg·L,酶活力为0.170 U·mg。结果表明,单点插入修饰后与野生型有着类似表达量和比活性,而随着突变位点的逐渐增加,酶表达量会有所下降。其次,通过超低温微波辐射和使用双功能交联剂快速制备精准的生物正交交联酶。在反应中首先通过预实验探究了Cu I剂量对ADH双点突变型粗酶酶活力的影响,发现0.4当量的Cu I作为催化剂时,能够保证具有催化活力的同时完成交联。掺入了非天然氨基酸(UAA,Unnatural amino acids)的双点修饰改造酶蛋白,可在微波辅助辐射下,在Cu I的催化下通过点击反应制备交联酶聚集体。为此,使用上述ADH双点突变体,加入1,11-二叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷通过环加成反应(Cu AAC)实现酶分子间交联,并通过扫描电镜、共聚焦荧光显微镜以及质谱等检测手段检测和验证确认了二点突变ADH双酶聚集体的交联。最后,构建光-酶催化手性催化还原方法并籍此合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。在此之前,探索了不同的Ti O催化材料在模拟光照下NADPH再生的催化过程,并对比了异丙醇(IPA)对反应结果的影响,发现不添加异丙醇(IPA)时Ti O纳米管生成NADPH的产率最高达59%,且该反应溶液中NADPH的浓度高达2.36 mg/m L;此外为证实氢的来源,通过电子自旋共振(ESR)手段检测了羟基自由基以及电子的生成,能够清楚地观察到一个相对强度为1:2:2:1的四线谱;同时ESR光谱显示出一个具有三个强度为1:1:1的峰的稳定信号,且信号强度会随着不断的而减弱,因而证实了氢和电子的生成,也为后续光-酶催化体系的催化反应的顺利进行提供了有力的证据。在此基础上,将此NADPH的光化学再生方法用于逆向催化的醇脱氢酶交联聚集体的催化还原过程,并以此法合成阿瑞匹坦中间体(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。通过HPLC光谱检测,随着时间的不断推移,(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量越来越高,反应24h后产率能达到41%,ee99.99%。同时为了确保Ti O纳米管和ADH交联聚集体能够重复使用,本文还进行了5轮批次重复使用,每次反应12h且产率皆能达30%左右,可见该型酶聚集体的催化稳定性,以及以水为氢供体的Ti O纳米管光催化再生NADPH的可行性。总之,本文通过掺入二点非天然氨基酸修饰乙醇脱氢酶制得精准交联的酶聚集体,有效克服了传统方法中化学交联的盲目性和随机性,保护了酶活性中心和催化活性;并以水为氢供体在Ti O纳米管光催化下再生NADPH,从而构建了光-酶催化手性催化还原方法,并籍此合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。该光-酶催化体系催化反应中,表现出了较好的重复使用稳定性。这种Ti O纳米管光催化NADPH的再生,以水供氢避免使用三乙醇胺等其他氢供体,大大提高了过程的绿色性和可持续性。因此,这种以Ti O纳米管光催化再生NADPH和精准交联酶聚集体催化还原的光-酶催化手性催化还原方法,可进一步扩展到其他酶催化的还原反应,并有望促进精细化学品或药物中间体的绿色和可持续催化合成。