基于胶体金免疫层析技术术中快速判断甲状腺乳头状癌淋巴结转移检测方法的建立

作     者：许利杰 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴开乐

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胶体金免疫层析 甲状腺癌 淋巴结转移 Cyfra21-1 即时检测 

摘      要：背景:2020年全球新增59万甲状腺癌病人,居全球癌症新发病率第九。95%的甲状腺癌恶性程度低,但早期局部淋巴结转移率高达40%-60%。术中快速诊断淋巴结有无癌细胞转移对于准确制定手术范围、彻底清除癌灶以及术后治疗至关重要。当前临床上术中检测淋巴结癌细胞转移方式主要为术中冰冻切片,由于术中冰冻切片假阴性率较高(5%-10%)、检测样本数量受限及耗时较长等因素极大地影响了甲状腺癌手术效率,因此临床实践中亟需一种术中快速判断淋巴结有无甲状腺癌细胞转移的方法。方法:胶体金免疫层析检测技术可将纳米技术、胶体金标记、免疫反应以及色层分析等多种检测方法结合在一起,是一种新型固相层析技术。具有检测快速、耗费低、灵敏度高、特异性强等多种优势条件,因此被广泛应用于即时检测。本课题主要致力于建立一种基于胶体金免疫层析技术术中快速客观判断甲状腺癌淋巴结转移的检测方法,主要通过以下几个方面来完成;1.制备检测淋巴结Cyfra21-1含量免疫层析试纸条:本次研究对于胶体金颗粒的制备条件、胶体金颗粒与抗体耦联的最佳PH值及最小抗体用量、胶体金释放速度、Cyfra21-1抗体的筛选及配对等多方面阐述了胶体金快速检测试纸条的制备及优化。2.检测并优化试纸条的性能:通过梯度稀释Cyfra21-1重组蛋白,层析读数仪读取不同浓度时T线及C线的灰度积分并且转化为T/C比值,绘制试纸条的标准曲线,运用Probit模型分析试纸条检测低值极限;运用试纸条检测CK8、CK18、EMA、ESA等上皮细胞标志物,判断试纸条检测特异性;常温下储存试纸条半年,测定检测效能;***21-1检测试纸条在临床样本中的应用:收集临床样本后进行后处理,试纸条检测淋巴结,判定淋巴结转移情况并与术后组织病理学结果相对比;免疫组化测定上述淋巴结中Cyfra21-1表达情况,并与病理学及试纸条检测结果对比。结果:1.合成的胶体金颗粒形态规则,平均直径33.50 nm,胶体金结合Cyfra21-1抗体最佳PH为7.8,最佳抗体浓度为2μg/ml,胶体金颗粒成功结合抗体;2.本次研发的试纸条检测极限值为0.55-1.14 ng/ml,标准曲线方程为:Y=0.003708×X+0.1101;R=0.9800,最快反应时间在12min以内,可常温下保存半年;3.本次研究共应用试纸条检测40枚甲状腺癌术中清扫的淋巴结,与术后组织病理学相比,试纸条灵敏度为100%,特异性为95%,与免疫组化结果相比,试纸条的灵敏度及特异性均为100%。结论:本次研究建立的甲状腺癌淋巴结转移检测方法便携、易于操作、价格低廉、快速、客观、灵敏度高、特异性好,适用于同时检测大批量淋巴结样本,可减轻病人麻醉时间,提高甲状腺癌手术效率,减轻社会疾病负担,临床应用前景广泛。