基于链取代放大的细菌微流控芯片检测方法研究

作     者：鹿宇麒 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王清江

授予年度：2021年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：微流控芯片电泳 链取代放大 mecA基因 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 鼠伤寒沙门氏菌 

摘      要：针对未来仪器分析便携化、微型化、集成化的发展趋势,应用微加工技术创建了微型全化学分析系统,其中重心领域是微芯片电泳技术(MCE)。该技术以芯片为核心,将化学、生物等领域的样品的制备、富集、衍生、分离以及检测等高效集成在微米量级的芯片操作单元平台上,是一种强大的核酸分析技术,广泛应用于化学、生物学及分子学等领域。但是,由于微流控芯片电泳光程较短、进样量比较少,导致检测灵敏度不够高。核酸放大策略可以利用核酸本身的扩增能力,使扩增过程得到循环,放大信号,提升灵敏度。致病菌的检测对于食品安全、临床诊断等领域具有重要意义。本论文将微流控芯片分析与链取代核酸信号放大策略相结合,对实际样品中的致病菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌)进行了高效灵敏地快速检测。通过各种实验条件的优化,提高了检测灵敏度。本论文的研究内容主要包含以下三个部分:第一章主要包括微芯片电泳的简要介绍、基本特征、在线富集技术、检测手段、应用领域以及各种DNA信号放大策略的介绍,并介绍了本论文研究的具体内容和意义。第二章设计等温链取代聚合酶反应(ISDPR)联合MCE的方法,并实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中mecA基因的检测。在本实验研究中,目标DNA通过与发夹探针(HP)特异性结合,打开DNA发夹结构,引物与探针杂交,在Klenow Fragment exo(KF exo)聚合酶作用下引物延伸取代目标DNA。释放的目标DNA与下一个HP杂交聚合延伸,再次被引物取代,从而实现目标的循环和扩增,并在MCE中检测HP-cDNA双链扩增产物。优化实验条件后检测限达到12.3pM(S/N=3),成功应用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。该方法体现了无标记、超灵敏、快速、分离效果好等优点。第三章设计了适配体介导双循环链置换扩增结合芯片电泳的方法,实现鼠伤寒沙门氏菌的检测。在本研究中利用适配体与细菌的特异性结合实现信号转换,并基于适配体介导的双循环链置换扩增联合微芯片电泳对鼠伤寒沙门氏菌进行了灵敏检测。用细菌与适配体的特异性结合释放触发DNA,引发循环扩增,产生大量目标检测单链。进行了适配体-触发链复合物浓度、模板链浓度、聚合酶浓度、核酸内切酶浓度以及孵育时间的优化。灵敏度显著提升,检测限低至6CFU/mL。采取此方法成功实现牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测,取得满意结果,体现该方法的可靠性、准确性以及应用潜力。