帕米尔高原低温微生物多样性及低温细菌TRM 85608耐冷机制初探

作     者：卜旭莹 

作者单位：塔里木大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张利莉;任敏

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：帕米尔高原 低温微生物 微小杆菌 DNA甲基化 DNA腺嘌呤甲基转移酶 耐冷机制 

摘      要：低温微生物广泛分布于地球多种低温环境中且具有独特的冷适应机制,不仅对自然界的元素循环有重要贡献,其产生的低温酶、表面活性剂等也在食品、洗涤剂、饲料、环境生物治理等领域被广泛应用。中国帕米尔高原为贫营养、高辐射、干燥的冷环境,可能蕴藏丰富且稀有的低温微生物资源。探究帕米尔高原的低温微生物多样性及低温微生物的耐冷机制,将有助于对帕米尔高原低温微生物的靶向勘探挖掘,改造提高微生物的低温耐受能力,实现低温微生物资源的充分利用。基于16S r RNA基因扩增子测序的免培养技术及分离培养的可培养技术,进行了帕米尔高原四个海拔(1000–2000 m、2000–3000 m、3000–4000 m、4000–5000 m)的72份土壤样品中低温微生物多样性探究。免培养结果显示,共获得11 051 494条有效序列,186 059个OTUs,赋值于1 176个属的细菌和39个属的古菌。海拔梯度由低至高,细菌域的优势属依次为劳尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、常丝藻属(Tychonema)和真杆菌属(Eubacterium),古菌域四个海拔的优势属均为Candidatus Nitrososphaera。类诺卡氏菌属(Nocardioides)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)与海拔高度呈正相关,而单胞菌属(Arenimonas)与之呈负相关。同时发现帕米尔高原土壤中的p H、P含量和p H、NO含量分别与帕米尔高原细菌和古菌的群落组成相关。经分离培养共得到487株低温细菌及25株古菌,隶属于61个属,148个种,包括潜在新物种37株。可培养结果显示,TSB和R2A培养基对以假单胞菌属(Pseudomonas)为主导的低温细菌的分离效果较好,NOM、F6和12%MGM培养基对古菌的分离效率较低,仅获得钠线菌属(Natrinema)和盐陆生菌属(Haloterrigena)的古菌。免培养及可培养结果显示,帕米尔高原存在丰富的微生物资源,四个海拔的微生物群落组成可能会受海拔及环境理化因子的影响。以一株低温细菌——水域微小杆菌(Exiguobacterium undae)TRM 85608为研究对象,基于转录组测序技术和单分子实时测序技术,对低温胁迫下代谢通路的变化和DNA甲基化与冷响应相关功能基因表达水平的关系进行了初步探究。结果显示,低温胁迫处理时,物质转运、能量代谢以及信号转导可能在该菌株低温耐受机能的形成过程中发挥主要作用。此外,DNA甲基化水平与m RNA的表达水平关联分析发现,有475个表达水平上调且未甲基化的基因,且RT-q PCR验证结果表明10个与冷胁迫相关的基因(fad M、crt Nb、sig V、met I、gro S、IRC3、csp E、btr、cue R及ahp C)表达水平均上调。另外,DNA腺嘌呤甲基转移酶基因下调的表达结果表明,该酶可能通过减弱催化能力,影响了基因组的DNA甲基化水平和基因的表达水平,可能是在低温下发挥关键调控作用的DNA甲基转移酶。结果初步表明DNA甲基化与低温细菌*** TRM 85608的耐冷特性相关。通过探究帕米尔高原低温微生物的群落组成、丰度,初步研究寒冷胁迫下低温微生物代谢通路的变化以及DNA甲基化与低温微生物的低温耐受性之间的关系,为帕米尔高原低温微生物资源的开发与利用及生态学功能研究提供了菌株材料和理论支持,也为全面解析低温微生物的寒冷耐受机制奠定了理论基础。