长牡蛎CgPIAS、CgSTAT和CgMx1参与抗病毒免疫的机制初探

作     者：李远眉 

作者单位：大连海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋林生

授予年度：2022年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：长牡蛎 Mx PIAS 干扰素 抗病毒免疫 

摘      要：干扰素(Interferon,IFN)系统是机体抗病毒免疫的重要组成部分。干扰素通过激活Janus激酶(Janus Kinases,JAK)和信号转导和转录激活子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT)信号通路,诱导下游干扰素刺激基因(Interferon-stimulated gene,ISG)表达,从而发挥抗病毒免疫效应。黏病毒抵抗蛋白(Myxovirusresistance,Mx)是一种重要的干扰素刺激基因,也是干扰素产生的重要标志。目前,对脊椎动物干扰素系统的研究比较深入,已经鉴定出多种ISG以及活化STATs蛋白质抑制剂(Protein inhibitor of activated STAT,PIAS),但在无脊椎动物中鲜有报道。本文以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,采用基因克隆、原核表达及RNA干扰(RNA interference,RNAi)等研究方法,鉴定了CgMx1和CgPIAS分子,旨在解析其在长牡蛎抗病毒免疫过程中发挥的调节作用。研究结果如下:1.在长牡蛎中鉴定出一个CgMx1和一个CgPIAS分子,它们均在血淋巴细胞中高表达。从长牡蛎中克隆鉴定到一个CgMx1和一个CgPIAS基因,其开放阅读框分别为1689和1887 bp,编码分别含有562和628个氨基酸的多肽,预测分子量大小分别为63.87和68.2 k Da,等电点分别为9.01和8.65。CgMx1蛋白含有一个N末端的动态GTP酶结构域。该结构域由三个GTP结合基序(GDXXSGKS,DLPG和T/NKXD)组成,在C端含有一个特殊的亮氨酸基序(L505、L512和L561)。系统进化分析发现其与无脊椎动物盘状鲍鱼(Haliotis discus discus)亲缘关系较近。CgPIAS蛋白具有相对保守的SAP、PINP和靠近C端的锌指结构域MIZ。系统进化分析发现CgPIAS与无脊椎动物的PIAS蛋白亲缘关系较近,与厚壳贻贝的PIAS3聚为一支。CgMx1和CgPIAS m RNA在长牡蛎多个组织中均有表达。CgMx1 m RNA在血淋巴细胞的表达水平较高(为唇瓣中的1342.45倍,p0.001),CgMx1蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞质和细胞核中。CgPIAS m RNA在血淋巴细胞中表达量较高,是外套膜中的32.98倍(p0.001),其次在鳃和唇瓣中的表达量也相对较高,分别是外套膜中的20.32和14.83倍(p0.001),在其他组织中的表达量则相对较低。***1参与CgIFNLP介导的抗病毒免疫应答。利用qRT-PCR和western blot检测了poly(I:C)和重组长牡蛎类干扰素蛋白(recombinant IFN-like protein,r CgIFNLP)刺激后血淋巴细胞中CgMx1的表达情况,结果显示CgMx1的表达量均显著升高,分别在刺激后的6 h和24 h处达到最高表达量(为对照组的13.14和66.28倍,p0.05)。其中r CgIFNLP刺激24 h后,CgMx1蛋白的表达量高于其对照组。利用RNAi技术分别干扰了CgIFNLP和CgSTAT的表达,其表达水平均显著降低分别为对照组的0.31和0.50倍(p0.05)。血淋巴细胞中CgMx1的表达量在poly(I:C)处理CgIFNLP和CgSTAT被干扰的牡蛎12 h后均显著下降,分别是对照组的0.02和0.04倍(p0.001)。凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)结果显示重组CgSTAT(r CgSTAT)蛋白可以直接结合CgMx1启动子中的干扰素刺激反应元件(Interferon-stimulated response element,ISRE)和伽马干扰素激活位点(Gamma interferon activation site,GAS),表明CgSTAT可以启动CgMx1的表达。据以上结果表明CgMx1通过CgIFNLP和CgSTAT介导的信号通路参与长牡蛎抗病毒免疫应答。***通过JAK/STAT信号通路介导长牡蛎类干扰素系统的抗病毒免疫应答。使用poly(I:C)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和rCgIFNLP分别刺激长牡蛎后,血淋巴细胞中CgPIAS的m RNA表达量均呈现出先升高后下降再升高的趋势。在poly(I:C)刺激组,血淋巴细胞中CgPIAS m RNA的表达量在刺激48h后高表达,是对照组的7.38倍(p0.001)。在灿烂弧菌刺激组,CgPIAS表达量在刺激72 h后高表达,是对照组的12.43倍(p0.01)。r