猪肉及其制品中三种病毒ASFV、PDCoV、SVA的多重RPA方法建立及应用

作     者：陈传君 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩国全;陈世界

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：重组酶聚合酶扩增技术 ASFV SVA PDCoV 

摘      要：非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性疾病,非洲猪瘟自2018年传入我国以来,对我国养殖业造成了巨大的破坏。截至2019年疫情累计捕杀生猪达102万头。A型塞内卡病毒（SVA）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）在国外均对养猪业造成了巨大的破坏,虽然未对我国养猪业造成较大的影响,但应该引起重视。2019年国务院非洲猪瘟防控工作要求猪肉制品加工企业应当对生猪原料产品进行检测并做好记录。重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为实现这一设想提供了可能性,该方法能够在较低的温度下（37～42℃）进行检测反应,所需时间较短（10～20 min）。本研究建立了ASFV、PDCoV和SVA的快速实时荧光RPA检测方法,以及能够对以上三种病毒进行同时检测的多重实时荧光RPA方法。具体研究结果如下:1.分别建立了ASFV、PDCoV、SVA的快速实时RPA荧光探针检测方法,均能够在20 min检测出结果,灵敏度分别为94 copies/μL、77 copies/μL、57 copies/μL。对ASFV的疑似阳性样品进行检测并与荧光PCR方法进行对比,结果一致,检出率100%。2.通过向非洲猪瘟阳性样品中添加食品肉制品中常用的添加剂或配料:食用盐、食用油、亚硝酸盐进行食品样品模拟,研究结果表明肉制品中的食用盐、食用油及亚硝酸盐不会对实时荧光RPA检测非洲猪瘟病毒造成影响。通过水煮、油炸、干燥模拟食品加工过程的影响,结果表明食品常用加工方式不会对实时荧光RPA检测非洲猪瘟病毒造成影响。3.建立了能够同时对ASFV、PDCoV、SVA进行快速检测的多重实时RPA荧光探针检测方法,能够在20 min检测出结果,灵敏度分别为940 copies/μL、770copies/μL、570 copies/μL。对ASFV的疑似阳性样品进行检测并与荧光PCR方法进行对比,准确性66.67%。本研究建立的实时荧光RPA检测方法具有灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单等特点,满足食品加工企业、市场监管部门等快速检测的要求。