‘21世纪’桃黄肉芽变的鉴定以及相关候选基因发掘

作     者：安明燕 

作者单位：河北科技师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张立彬;苏凯

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：桃 类胡萝卜素 生物信息学 转录组 

摘      要：桃（Prunus persica（L.）Batsch）根据肉质色泽可分成白肉、黄肉和红肉,白肉桃和黄肉桃是最常食用的品种类型,果实颜色受一对等位基因控制,白肉为显性,黄肉为隐性。黄肉桃与白肉桃之间的肉质色泽差异,主要是因为类胡萝卜素的含量。黄肉桃内含大量的类胡萝卜素,对人体具有良好的保健作用。类胡萝卜素的试材种类以及含量对水果、蔬菜以及花卉植物的颜色有着显著的影响。为研究黄肉桃果实色泽产生的重要因素,本试验以‘21SJ’和‘21BM’的叶片及果肉为主要试验材料,采用芽变鉴定、类胡萝卜素含量种类分析,转录组学分析、候选基因克隆和生物信息学解析等方式开展实验研究具体结果如下:1、本试验设计180对引物中筛选出88对引物即桃的每条染色体筛选出11对引物,发现‘21SJ’和‘21BM’的DNA扩增出的条带长度和条带个数相同,‘21SJ’和‘21BM’初步鉴定为芽变。2、利用高效液相色谱法,检测了‘21SJ’和‘21BM’在花后45d、65d、85d、105d、125d的果实中类胡萝卜素的类型和含量,并测定出了13种类胡萝卜素,在‘21SJ’果实中,花药黄质、玉米黄质、β-隐黄质的含量随着果实成熟期而逐步降低,但在‘21BM’果实的花药黄质、玉米黄质、β-隐黄质的含量在花后125d果实成熟期明显提高;‘21SJ’果肉中的β-胡萝卜素、紫黄质、叶黄质、新黄质的含量逐步减少,而‘21BM’的β-胡萝卜素花后45d到105d逐步减少,到花后125d出现上升趋势,而紫黄质含量则从花后45d到85d逐步减少后又呈上升趋势,叶黄质含量则先增加后减少;‘21SJ’和‘21BM’果实中的α-胡萝卜素、六氢番茄红素、八氢番茄红素、角黄质、海胆烯酮的含量无明显规律。3、本试验对‘21SJ’和‘21BM’花后65d、85d、105d的果肉进行转录组学分析,筛选出1对显著差异的基因CCD4基因并进行荧光定量验证,CCD4基因是作用于类胡萝卜的代谢途径,‘21SJ’CCD4基因转录水平逐渐升高,而‘21BM’CCD4基因的转录水平呈现先上升后降低的趋势。由于果实成熟后期‘21BM’CCD4基因转录水平降低,‘21BM’果肉中CCD4酶剪切类胡萝卜素的速率降低致使‘21BM’果肉中隐黄质、玉米黄质、花药黄质、β-胡萝卜素的含量均显著高于‘21SJ’,由此CCD4基因是‘21SJ’黄肉芽变的关键基因。4、本试验从‘21SJ’和‘21BM’果肉中成功分离出CCD4基因,并对CCD4基因进行生物信息学分析,结果显示,‘21SJ’和‘21BM’的CCD4基因与NCBI预测的Pp CCD4基因（XP＿007222433.2）编码区序列完全一致,Pp CCD4蛋白由20种氨基酸构成,其中色氨酸含量是最低,脯氨酸含量最高;Pp CCD4蛋白属于高度稳定的非跨膜亲水性蛋白;Pp CCD4蛋白与李、梅、樱桃等蛋白序列相似性可达98.99%、98.16%、96.82%;Pp CCD4蛋白与蔷薇科李子、梅、樱桃聚为一个类别之后与海棠、蔷薇聚为一类,与李的亲缘关系最近。Pp CCD4蛋白的二级结构有无规则卷曲（c）、延伸连（e）、α螺旋（h）和β转角（t）,其中无规则卷曲（c）占比最高可达63.65%。