快速修饰蛋白质赋予其过氧化物酶活性及构建新型生物传感方法研究

作     者：花欣怡 

作者单位：湖南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄昊文

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：蛋白质修饰 酶活性 生物传感器 铁卟啉 

摘      要：本论文主要对蛋白质进行修饰并将其应用于构建生物传感研究。首先用酒石酸选择性地修饰血红蛋白生成酒石酸-血红蛋白复合物,这一过程增强了血红蛋白的过氧化物模拟酶活性。且基于该复合物的催化特性,构建了可视化方法检测人血清样本中的血红蛋白。其次基于羧基与铁卟啉快速配位这一特性,发展了铁卟啉快速修饰蛋白质的方法。这种蛋白质修饰方法可赋予其过氧化物模拟酶活性,利用其催化活性构建了新型生物传感平台,实现快速有效的蛋白质检测新方法。并用该方法证明了检测糖尿病临床相关的蛋白质的可行性。最后利用铁卟啉对葡萄糖氧化酶进行修饰制备同时具有双重酶活性的复合物,实现了一步法比色检测血液中的葡萄糖浓度,并将该双酶应用于杀伤癌细胞与抑制大肠杆菌。具体的研究内容如下:(1)在本研究中,开发了一种简便的方法,用酒石酸(TA)快速、选择性地修饰血红蛋白(Hb)中的血红素,形成(TA-Hb)复合物,这种复合物具有过氧化物模拟酶活性,其催化活性可与天然辣根过氧化物酶相媲美。通过紫外-可见吸收、荧光、荧光寿命和圆二色性数据表征了随着TA-Hb复合物形成Hb的结构变化。酒石酸羧基的氧原子很容易与血红素配位,成为卟啉的轴向配体,这种特定结构有利于形成稳定的中间体,显著增强Hb过氧化物模拟酶活性。此外,还利用TA-Hb的特性,开发了一种快速检测人血清样本中Hb浓度的比色分析法,无论样品是新鲜的还是长期储存的,是液体的或干燥的。该比色法可在0.01～0.1 mg/m L的浓度范围内检测Hb,检测限(LOD)为0.1μg/m L。(2)构建了一种蛋白质修饰新方法。通过用铁卟啉原位快速、直接处理靶蛋白,氨基酸的羧基与TPPFe分子空腔结构中心的铁离子结合,形成稳定的蛋白质复合物。这种复合物不仅保持了原始蛋白质的完整性和功能性,且可以获得新的过氧化物酶活性,可以催化HO分解产生羟基自由基,在此基础上,创建了一种检测蛋白质的新型生物传感平台。该方法简单易行,消除了传统ELISA方法酶标抗体复杂的交联过程。实验表明该方法可用于血液样本中糖尿病临床相关蛋白的快速检测,为临床诊断、食品安全和环境监测提供了新途径。(3)通过铁卟啉修饰葡萄糖氧化酶,赋予新的过氧化物模拟酶活性,使其具备双重酶活性,可实现葡萄糖-双氧水-羟基自由基的级联反应。基于该双酶活性,设计了一步法比色检测血液中的葡萄糖,仅需向血液中加入葡萄糖氧化酶即可原位与血红素反应生成双酶复合物,实现了在0.01-0.4 m M浓度范围区间可定量检测血糖浓度,该方法检测限(LOD)为0.0002 m M。并将该双酶应用扩展至细胞毒性以及抑菌实验,表征了蛋白质修饰后的多种用途。