致害性不同的两种褐飞虱触角转录组及NlOrco基因功能研究

作     者：张丽 

作者单位：信阳师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：荆胜利;黄斌

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：褐飞虱 致害性 转录组分析 嗅觉受体 嗅觉共受体 

摘      要：褐飞虱（Nilaparvata lugens）是水稻上重要的害虫之一。近年来,褐飞虱的防治手段主要是喷施化学杀虫剂和种植抗性水稻品种。在抗性水稻品种种植过程中,褐飞虱逐渐进化出克服相应抗性基因的致害褐飞虱群体,使其防治效果减弱。褐飞虱在适应抗性水稻过程中,其生理和寄主选择行为发生一定改变。前期“H型嗅觉仪行为测定结果表明致害性不同的两种褐飞虱（生物型1和生物型Y）对两种水稻品种（感性水稻TN1和含Bph15抗性基因水稻YHY15）选择出现明显差异,但具体机制仍不清楚。为此,本研究以两种致害性不同的褐飞虱为研究对象,它们的触角并进行比较转录组分析,筛选差异表达的嗅觉相关基因,并挑选NlOrco基因进行功能分析。主要研究结果为下:1.解剖两种褐飞虱触角比较转录组分析解剖致害性不同的两种褐飞虱若虫和成虫触角,即:生物型1成虫触角（TA）、生物型1若虫触角（TL）、生物型Y成虫触角（YA）和生物型Y若虫触角（YL）,提取RNA,并送公司进行RNA测序。测序结果表明,大约有80%的原始序列数比对到参考基因组上,其中有超过60%的原始序列可以比对到参考基因组的唯一位置,说明数据质量良好,可信度高。主成分分析和聚类分析结果均表明不同生物型之间以及成虫和若虫之间触角表达基因均存在一定差异。差异表达基因分析显示,在生物型1成虫和若虫中（TA vs TL）共有6363个表达差异显著基因;在生物型Y成虫和幼虫中（YA vs YL）共有表达差异显著基因8915个;在生物型1和生物型Y的成虫中（TA vs YA）共有表达差异显著基因3006个;在生物型1和生物型Y的若虫（TL vs YL）共有表达差异显著的基因5157个。对筛选出的差异基因进行基因本体（gene ontology,GO）富集分析,结果显示发现两种生物型褐飞虱成虫和若虫间差异表达基因均能显著富集在与嗅觉相关的GO条目。然后对褐飞虱基因组数据库进行同源比对和基因注释,从褐飞虱触角转录组中鉴定出的127个嗅觉相关基因,其中在生物型Y成虫和若虫（YA和YL）虫中表达上调的有9个ORs基因,表达下调的有7个ORs基因和1个OBPs基因;在生物型Y成虫（YA）有1个ORs表达上调,表达下调的有12个ORs和1个OBPs;在生物型Y若虫（YL）表达上调的有21个ORs和1个OBPs,表达下调的有1个ORs和1个OBPs。2.褐飞虱NlOrco基因克隆及功能研究褐飞虱NlOrco基因全长2247 bp,编码478个氨基酸。两种褐飞虱NlOrco基因核苷酸序列只有12个碱基不一致,但其编码的氨基酸也完全一致,都含有7个跨膜结构域,说明该基因在褐飞虱适应抗性水稻过程虽在核苷酸水平有突变但不影响其蛋白保守性。其次,时空表达模式分析结果表明,NlOrco基因在若虫期的5个虫龄之间表达量差异较小,而成虫期表达量明显高于若虫期,且雄虫的表达量最高;在触角的表达量显著高于其他组织（头部,足,胸部和腹部）,其他组织之间表达量差异较小,但在头部和足的表达量明显高于胸部和腹部。通过RNAi技术分别敲低两种褐飞虱NlOrco基因后,其对感性和抗性水稻品种均没有明显的选择偏好性。这些结果说明,尽管适应抗性水稻后生物型Y褐飞虱寄主选择行为发生变化,但其NlOrco基因在进化上仍然十分保守。本研究结果将为褐飞虱嗅觉识别系统研究奠定基础,同时也为基于嗅觉的褐飞虱防控提供一定理论依据,为开发新型安全有效的生物害虫防治和监控技术提供理论支持。