基于PI3K/Akt通路研究青蒿琥酯对涎腺腺样囊性癌细胞增殖侵袭转移能力的影响及机制研究

作     者：马里程 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：农晓琳

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：腺样囊性癌 青蒿琥酯 磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白激酶B 雷帕霉素靶蛋白 

摘      要：目的:通过体外实验研究青蒿琥酯(Artesunate,ART)对涎腺腺样囊性癌细胞在增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学功能方面的影响,明确ART是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对腺样囊性癌细胞产生抑癌作用及其可能的作用机制。方法:通过对SACC-83系腺样囊性癌细胞进行不同浓度的ART药物处理,以检测该药物对SACC系腺样囊性癌细胞是否有相关抑制作用。1.药物浓度筛选实验,采用8个不同浓度梯度的ART分组,药物浓度具体如下:25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L,1600μmol/L和3200μmol/L等,分别对SACC-83腺样囊性癌细胞作用24 h、48h以及72 h之后,采用CCK-8细胞增殖/毒性实验方法检测该药物对细胞的毒性作用,并根据该实验结果选出后续的用药工作浓度。2.检测不同工作浓度下的ART对人腺样囊性癌细胞是否有生物学功能。采用CCK-8法检测细胞增殖能力改变,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力改变,细胞划痕实验检测细胞横向迁移能力改变,Transwell基质胶侵袭实验检测细胞侵袭能力改变,Transwell迁移实验检测细胞纵向迁移能力改变等。3.免疫细胞化学染色法对不同药物浓度处理后的人腺样囊性癌细胞SACC-83中蛋白表达水平的变化情况进行检测。4.采用免疫荧光染色法检测SACC-83细胞中PI3K、Akt、mTOR等相关蛋白表达水平的变化。5.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测不同工作浓度的ART药物处理48 h后的SACC-83细胞中PI3K、Akt和mTOR等相关目的基因的表达水平变化。6.采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)实验方法检测SACC-83细胞中PI3K、Akt和mTOR等蛋白表达水平变化。结果:1.通过CCK-8检测结果可知,在不同ART浓度作用下SACC-83细胞生长明显受到不同程度抑制,并且抑制程度呈药物浓度依赖性,同浓度下干预时间越长,抑制效果越强。ART对SACC-83细胞的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC)为(427.57±37.34)μmol/L,IC为(61.36±17.54)μmol/L,根据1/4 IC及1/2 IC设定参考值范围,则后续实验ART以15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L及240μmol/L等作为实验的药物工作浓度,且选择处理时间在48 h时可获得较佳的干预效果。2.平板克隆形成实验结果显示,SACC-83细胞在ART药物处理后,克隆形成集落数明显降低,且随ART药物浓度的增加而减少,各组间差异有统计学意义(P0.05);细胞划痕实验可见不同浓度的ART干预组间比较,相同时间内240μmol/L浓度组的SACC-83细胞横向迁移数量最少;且与空白对照组相比,SACC-83细胞的横向迁移数量随ART浓度增加而降低,各组间差异有统计学意义(P0.05);Transwell迁移实验结果显示,浓度为15μmol/L的ART干预后SACC-83细胞转移数较空白照组显著降低,且随浓度的增加,相同时间内SACC-83细胞迁移数量逐渐减少,各组间差异有统计学意义(P0.05);Transwell基质胶侵袭实验示浓度为15μmol/L的ART干预后的SACC-83细胞侵袭数较正常癌细胞对照组显著降低,且随浓度的增加,相同时间内SACC-83细胞的侵袭数量逐渐减少,各组间差异有统计学意义(P0.05)。3.免疫细胞化学法实验结果表明,6个不同浓度梯度的药物组比较时,显微镜下可见ART浓度在0μmol/L时细胞染色后平均光密度值最高;其余干预组的细胞中PI3K,Akt,mTOR的蛋白表达均随药物浓度的增加而递减。各组间差异有统计学意义(P0.05)。4.采用qPCR定量检测SACC-83细胞中PI3K、Akt、P-Akt及mTOR基因的表达情况,结果显示,相同处理时间下,PI3K、Akt、P-Akt及mTOR的m RNA相对表达量均随药物浓度的增加而显著降低,各组间差异有统计学意义(P0.05)。5.Western Blot实验结果显示,SACC-83细胞经过不同浓度梯度的ART药物处理48 h后,PI3K、Akt、P-Akt及mTOR等蛋白的相对表达量均较未处理组明显下调,且各组间差异有统计学意义(P0.05)。结论:青蒿琥酯可抑制人唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83的体外增殖、克隆及侵袭迁移等生物学行为,其抑制能力呈药物浓度依赖。ART可下调通路中关键因子PI3K、Akt、mTOR的分子表达量,提示机制与可能PI3K/Akt/mTOR通路的调节有关。