橡胶树乳管HbPIPs的H2O2运输功能鉴定及其对胶乳ROS水平的影响

作     者：杨萍 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：校现周;黄瑾

授予年度：2020年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：橡胶树 水通道蛋白 H2O2含量 荧光强度 乙烯利刺激 

摘      要：橡胶树乳管细胞是由分布在韧皮部中的形成层细胞分化产生,在橡胶树产排胶生理学的基础研究中占有极其重要的地位。产排胶过程与橡胶树韧皮部的水分平衡密切相关,而植物水通道蛋白(Aquaporin,AQP)作为质膜和液泡膜上专一、高效的水分跨膜双向运输通道,能够灵敏高效调节胞质间和胞内的水分流动的同时参与体内活性氧的调节,有利于植物的正常生长代谢。因此,细胞膜上存在的高效特异水通道蛋白可能参与橡胶树胶乳活性氧的运输,但是有关方面的研究仅有在橡胶树上克隆出水通道蛋白基因,并局限在未开割树和部分水通道蛋白对其水分运输功能的鉴定。本研究以我国目前大面积种植的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)热研7-33-97为材料,运用乙烯利刺激橡胶树,分析在排胶过程中胶乳HO含量、CAT含量、蛋白羰基含量及抗氧化酶活性;采用AR、HDCFDA探针标记的方法,在体外提供HO的条件下,分别采用荧光电镜和荧光定量分析4个水通道蛋白基因重组酵母细胞后HO和ROS的荧光强度,鉴定乳管质膜水通道蛋白HbPIP1;4、HbPIP2;3、HbPIP2;5、HbPIP2;7运输HO功能;以期揭示乳管质膜水通道蛋白HbPIPs运输HO的能力以及对胶乳ROS水平的影响。研究结果如下:1.乙烯利刺激橡胶树,胶乳HO含量在排胶过程存在显著性变化。高浓度(10%)的乙烯利刺激,在排胶初期,胶乳中HO含量与对照组无显著性差异,HO含量维持在较高的水平,树皮中HO含量也出现同样的现象。随排胶时间延长,在排胶90min时,胶乳中HO含量达到最大;排胶终期,胶乳HO含量显著高于排胶初,而树皮HO含量显著低于排胶初。初步表明高浓度乙烯利刺激,能够使得胶乳中积累大量HO,但是在排胶初期,胶乳和树皮产生的HO可能完全能够被体内的活性氧清除机制所清除。此外,胶树体内正常排胶有利于降低HO对树皮造成的氧化伤害,对于热研7-33-97橡胶树,树皮组织氧化损伤情况也能反映乳管细胞的氧化损伤情况。2.乙烯利刺激橡胶树,胶乳蛋白羰基含量和MDA含量在排胶过程存在显著性变化。排胶初,胶乳蛋白羰基含量维持相对较低的水平,但是随着排胶时间的延长,胶乳蛋白羰基含量出现逐渐升高后降低的趋势,并且在排胶终期含量显著高于排胶初;胶乳蛋白羰基含量与对照组相比提前达到最高水平。而胶乳MDA含量在排胶过程中出现降低-增加-降低的趋势,但是对照组只是在排胶终MDA含量显著增加。说明高浓度乙烯利刺激橡胶树,胶乳蛋白羰基含量以及丙二醛含量升高。表明高浓度乙烯利刺激胶树,会进一步增强乳管细胞的氧化损伤程度。3.本研究发现当涂施乙烯利刺激橡胶树,胶乳CAT、POD、T-AOC、PPO活性均显著性升高。随着排胶时间的延长,抗氧化酶活性不同,暗示CAT、POD、T-AOC、PPO在胶乳活性氧调节过程中发挥很大作用。随着排胶时间的延长,涂施5%乙烯利刺激橡胶树,胶乳CAT酶活性在60 min时达到最大,胶乳POD较低,而T-AOC、蛋白羰基含量维持在一个相对稳定的水平;在排胶结束时,乙烯利刺激增加了CAT、POD活性以及蛋白羰基含量,而总抗氧化能力显著降低;PPO活性在排胶初始时最强,而当停止排胶时,其活性显著降低,推测PPO可能参与乙烯的调控并且促进排胶。4.通过荧光探针分析重组酵母细胞。AR探针,HbPIP1;4、HbPIP2;3、HbPIP2;5表达,细胞内荧光信号强度在45 min内逐渐增强,而HbPIP2;7表达,细胞内HO数量在前15 min波动较大,其次绿色荧光HDCFDA探针也出现同样现象。说明HbPIP1;4、HbPIP2;3、HbPIP2;5、HbPIP2;7蛋白都具有运输HO的能力,但HbPIP2;7蛋白运输HO较弱。综上所述,高浓度乙烯利刺激橡胶树,胶乳HO过氧化氢含量升高,对胶树造成极大的氧化伤害。橡胶树乳管质膜水通道蛋白HbPIP1;4、HbPIP2;3、HbPIP2;5、HbPIP2;7都具有运输HO的能力。本研究对橡胶树产排胶研究具有重要的理论意义。