基因工程化细胞膜囊泡在肿瘤免疫治疗中的研究

作     者：郑东烨 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘小龙

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：免疫治疗 肿瘤微环境 程序性死亡受体1 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 过氧化氢酶 

摘      要：免疫治疗作为一种新型的肿瘤治疗方式,因其卓越的疗效和创新性,被誉为癌症治疗的希望,从根本上改变了我们对癌症治疗的看法。肿瘤免疫治疗是应用免疫学方法和原理,通过增强人体自身的抗肿瘤免疫应答,来实现对肿瘤细胞的识别与清除,抑制肿瘤生长。但是,目前肿瘤免疫治疗在实体瘤上的应答率有限(10%-35%),能够获得持久疗效的患者仍然为数不多且存在明显的个体差异。大多数实体瘤缺乏免疫细胞浸润并且突变负荷较低(“冷肿瘤),未被免疫系统识别或未引起强烈的抗肿瘤免疫反应。基于此,我们开发了一种新型的基因工程化细胞膜囊泡(BFVs/PD1-TRAIL-CAT),通过诱导肿瘤免疫原性死亡、改善肿瘤乏氧微环境和阻断免疫检查点抑制来增强机体的抗肿瘤免疫。BFVs/PD1-TRAIL-CAT表面负载程序性死亡受体1(PD1)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL),同时将过氧化氢酶(CAT)载入囊泡内部。其中,TRAIL可以特异性诱导肿瘤细胞死亡,启动机体抗肿瘤免疫应答;CAT可以与肿瘤部位高丰度的HO反应生成O,缓解肿瘤部位的乏氧状态,增加效应T细胞向肿瘤内部浸润,减少肿瘤内的免疫抑制细胞;PD1可以阻断PD1/PDL1免疫抑制信号通路,恢复CD8T细胞杀伤活性,进一步协同增强免疫应答。通过上述功能的有机整合,实现肿瘤免疫抑制微环境综合调控(“冷—热肿瘤高效转换)和自身免疫体系的快速重建,有助于延长肿瘤患者生存期,提高患者生存质量,降低肿瘤复发转移威胁,提高治愈率。实验内容:1)运用基因工程技术构建稳定表达PD1和TRAIL的细胞株,提取细胞膜,负载过氧化氢酶,制备基因工程化细胞膜囊泡。通过Western Blot、透射电镜、粒度电位分析仪、共聚焦显微镜、流式细胞仪、免疫共沉淀等技术对细胞膜囊泡进行了结构表征和性能检测。2)在体外溶液和细胞水平对细胞膜囊泡中PD1蛋白的免疫检查点阻断功能,TRAIL蛋白的肿瘤细胞特异性“免疫原性杀伤功能,以及CAT催化HO产生O情况进行验证。3)构建小鼠双侧乳腺癌模型,其中一侧肿瘤视为原发灶进行瘤内治疗,另一侧肿瘤未作处理,同时观察两侧肿瘤的生长情况并分析肿瘤内部免疫细胞的类型、数量及状态,并检测肿瘤组织中促炎性细胞因子含量水平,研究细胞膜囊泡的系统性抗肿瘤免疫反应。4)构建小鼠原位乳腺癌模型,尾静脉注射细胞膜囊泡,监测其在体内分布和药物代谢动力学变化规律,并通过肿瘤体积变化、肿瘤病理分析等评估细胞膜囊泡对原位肿瘤的抑制效果,同时考察小鼠肿瘤附近引流淋巴结DC细胞成熟,肿瘤内T细胞浸润情况和免疫状态,进一步验证机体抗肿瘤免疫效应。5)免疫治疗后的小鼠通过尾静脉注射肿瘤细胞,观察肿瘤肺转情况并分析外周血中记忆性T细胞分布情况,验证免疫记忆性。实验结果:1)成功构建了可在细胞膜上表达PD1和TRAIL的稳转细胞株,并提取出细胞膜组分制备了基因工程化细胞膜囊泡,透射电镜结果证实了囊泡结构,粒径约为100 nm,电位为-24.9 m V,免疫沉淀结果证明了细胞膜囊泡表面蛋白的正确朝向。2)体外研究结果证明:细胞膜囊泡表面的PD1可与肿瘤细胞表面的PDL1结合,并阻断PD1/PDL1免疫检查点,提高CD8T细胞对肿瘤细胞的杀伤;细胞膜囊泡表面的TRAIL可与肿瘤细胞表面的死亡受体结合,特异性诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,释放CRT等“危险信号分子,促进DC细胞成熟和T细胞增殖;细胞膜囊泡中的CAT可催化HO产生O,改善肿瘤乏氧微环境,促进效应T细胞的浸润,降低免疫抑制细胞的比例。3)体内抗肿瘤实验结果证明:在双侧肿瘤模型上,细胞膜囊泡可同时抑制原位肿瘤和远端肿瘤的生长,说明细胞膜囊泡具有抗肿瘤“远端效应(提高机体系统性免疫应答能力);在小鼠乳腺癌原位模型上,细胞膜囊泡经系统性给药后,在原位瘤中也能发挥良好的抗肿瘤效果,并且可以调动机体全身性免疫反应。此外,我们也证明经细胞膜囊泡治疗后的小鼠具有免疫记忆性,可以抑制肿瘤肺转移。4)免疫治疗机制分析:细胞膜囊泡可提高肿瘤部位的效应T细胞的浸润性和促炎性细胞因子的分泌水平,同时降低免疫抑制性细胞和抑炎性细胞因子分泌。实验结论:细胞膜囊泡BFVs/PD1-TRAIL-CAT具有良好的抗肿瘤效果,实现了肿瘤免疫抑制微环境综合调控,将“冷肿瘤高效转换成“热肿瘤,显著抑制肿瘤生长、复发和转移,提升免疫治疗效果。