芦可替尼和BGB324可协同抑制与HS-5 transwell共培养的HEL细胞机制的研究

作     者：张梦潇 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：左学兰

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：HEL细胞 HS-5细胞 芦可替尼 BGB324 Gas6/Axl信号通路 

摘      要：目的:骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPNs)是一种造血干细胞克隆增殖性肿瘤,JAK2抑制剂芦可替尼的使用可降低MPNs患者症状负荷、提高生活质量以及延长总生存期,但仍有部分患者对芦可替尼的治疗反应不佳或不耐受。近年来研究发现Gas6/Axl信号通路与多种肿瘤的增殖和耐药有关,而AK2相关的MPNs中Axl被上调和过度激活,抑制Axl优先杀死PV患者的肿瘤细胞,但具体机制仍不清楚。BGB324是一种靶向Axl的高选择性抑制剂,将芦可替尼和BGB324单独和联合使用,研究其对与骨髓基质细胞HS-5 transwell共培养后的HEL细胞的抑制效应,验证Axl抑制剂干预MPNs的可行性,并对可能的机制进行探讨。方法:ELISA法检测初诊MPNs患者和健康供者外周静脉血上清IL-6和Gas6水平。将处于对数生长期的HS-5细胞(1×10/ml)和HEL细胞(1×10/ml)进行transwell共培养作为实验组,以单独培养的HEL细胞(1×10/ml)或HS-5细胞(1×10/ml)作为对照组。芦可替尼和BGB324单独或联合作用实验组和对照组48h后,CCK8法检测各组IC值,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率,ELISA法检测各组IL-6及Gas6的水平,RT-PCR检测各组IL-6和Gas6基因表达量,Western Blot免疫印迹技术检测各组Axl、p-Axl、p-Stat3、p-Stat5、p-Akt和Bcl-2蛋白的表达量。结果:MPNs患者外周静脉血上清IL-6和Gas6平均含量明显高于健康供者(P0.05),单独培养和transwell组的HEL细胞分别经不同浓度的芦可替尼或BGB324作用48h后,其增殖均受到抑制,且transwell组的HEL细胞对药物敏感性降低。联合用药比单用药促HEL凋亡作用明显,并且药物作用于transwell组HEL细胞的凋亡率均比相对应的单独培养组HEL细胞的凋亡率低(P0.05)。Transwell组上清IL-6和Gas6水平均比单独培养组高,联合用药比单独用药使IL-6和Gas6水平降低更明显(P0.05)。Transwell组HEL细胞IL-6和Gas6基因表达量与HEL细胞单独培养组相比,变化不明显;而transwell共培养组HS-5细胞IL-6和Gas6基因表达量与HS-5细胞单独培养组相比明显增高(P0.05),芦可替尼与BGB324单独或者联合作用于transwell组48h后,HEL细胞IL-6基因表达量降低,Gas6基因表达量未有明显变化,HS-5细胞的IL-6和Gas6基因表达量明显降低(P0.05)。与单独培养的HEL细胞相比,transwell共培养12、24、48h后的HEL细胞Bcl-2、p-Axl、p-Akt、p-Stat5和p-Stat3表达逐渐升高,芦可替尼单用时HEL细胞Bcl-2、p-Akt、p-Stat5和p-Stat3表达量降低,而p-Axl和Axl的表达无明显变化。BGB324单用时HEL细胞p-Axl、Axl、Bcl-2、p-Akt、p-Stat5表达量降低,而p-Stat3表达无明显变化,联合用药比单独用药后Bcl-2、p-Akt、p-Stat5和p-Stat3表达量降低更加显著。结论:HS-5细胞在transwell共培养体系中支持HEL细胞的存活并抵抗芦可替尼的促凋亡作用,芦可替尼联合BGBG324应用可通过下调IL-6和Gas6的表达并抑制Gas6/Axl、JAK/STAT和PI3K/Akt信号通路的激活以及降低Bcl-2的表达从而逆转HEL细胞对芦可替尼的耐受并促进HEL细胞的凋亡。