地衣芽胞杆菌BL-1的生物学特性研究与发酵工艺优化

作     者：李则静 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：石徳时;肖运才

授予年度：2016年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 081703[工学-生物化工] 0905[农学-畜牧学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：地衣芽胞杆菌 生物学特性 发酵工艺 

摘      要：地衣芽胞杆菌是“公认安全(GRAS)的饲用益生菌,具有生长速度快、抗逆性强等良好益生特性,在畜牧生产中广泛应用。为丰富地衣芽胞杆菌产品,本试验从实验室保存的三株疑似地衣芽胞杆菌中,筛选出一株生长速度快、抑菌性好、粘附能力强的地衣芽胞杆菌BL-1,并对BL-1菌株进行抗逆性的研究和发酵工艺的优化。试验结果如下:一、地衣芽胞杆菌的鉴定本试验通过细菌形态学观察、生理生化反应、16S r RNA基因鉴定技术对三株疑似菌株进行鉴定,得出菌株BL-1、BL-3为地衣芽胞杆菌。二、地衣芽胞杆菌生物学特性的研究本试验通过生长曲线的测定、抑菌性和粘附能力的比较,筛选得到优势菌株BL-1,并对其进行抗逆性试验(耐高温、耐酸、耐胆盐)。试验结果如下:(1)优势菌株的筛选:两株地衣芽胞杆菌均在2h内直接进入对数期,并在稳定期保持10h左右,最大菌量均在25.00×10CFU/m L左右,BL-1在第6h进入稳定期,BL-3在第16h进入稳定期,BL-1生长周期较BL-3少10h左右;两者对大肠杆菌K88和猪霍乱沙门氏菌均无明显抑菌作用,BL-1对金黄色葡萄球菌ATCC的抑制作用显著强于BL-3(P0.01);BL-1对IPEC-J2细胞的粘附率为1.27%显著高于BL-3的粘附率0.01%(P0.01)。综合以上三个方面的试验得出:与BL-3相比,BL-1具有生长速度快、抑菌性好、粘附能力强的显著性优势,且BL-3生长16h才进入稳定期,不适于工业生产,选择BL-1进行接下来的抗逆性试验。(2)抗逆性试验:BL-1在80℃和90℃水浴10min、20min、30min的存活率分别为92.73%、90.45%、86.36%和88.64%、82.27%、80.00%;用p H值为2和3的模拟胃液处理BL-1 4h,其存活率分别为85.33%、83.75%;胆盐会抑制BL-1的生长,但BL-1的活菌数一直保持在10CFU/m L左右。说明,菌株BL-1具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐能力。三、地衣芽胞杆菌BL-1发酵工艺的优化本试验通过对初始培养基的筛选和响应面法的应用,对BL-1的种子培养基、发酵培养基进行了优化。试验结果如下:(1)对选取的4种种子培养基进行研究,得到的最适于BL-1的种子培养基为牛肉膏大豆蛋白胨培养基,250m L锥形瓶的最佳装液量为25m L,最佳初始p H为8.0,最佳接种时间为11～12h;(2)对选取的3种发酵培养基进行研究,得到最适于BL-1的发酵培养基(大米粉13g、面粉30g、豆粕粉15g、酵母粉8g、Mg SO·7HO 3.5g、Na Cl 2.5g、Ca CO3.5g、Na HCO0.15g、KHPO0.1g、水1L;p H7.5)作为用于优化的初始发酵培养基。并通过PB试验、最陡爬坡试验和响应面法确定影响地衣芽胞杆菌BL-1发酵的主要因子和各因子的最佳配比:大米粉(4.72g/L)、豆粕粉(37.8g/L)、酵母粉(4.6g/L),其他因子保持不变。(3)250m L锥形瓶中装入优化后的发酵培养基和优化前的培养基各25m L,调节初始p H为8.0,在37℃的摇床中,以200r/min振荡培养48h,芽胞数为53.57×10CFU/m L,是优化前芽胞数的5倍左右。