ChIFNs基因对烟草生长发育和TMV抗性的影响及机制

作     者：董亚萍 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋莉

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：鸡干扰素 转基因烟草 生长发育 烟草花叶病毒 抗病性 调节机制 

摘      要：抗病品种的培育和应用是控制烟草病毒病的一条有效途径。课题组前期研究中,利用具有诱导基因表达、抗病毒和免疫调节等广泛生物学活性的动物细胞因子——鸡干扰素编码基因(Ch IFNs)创制出Ch IFN-α、Ch IFN-γ及二者的杂交烟草(Ch IFN-α-γ)三种转基因烟草(TP)。本论文通过ELISA、RNA-seq、q RT-PCR等技术,开展Ch IFNs基因表达对上述转基因烟草生长发育和TMV抗性的影响,及其植物调控机制研究,以为转Ch IFNs转基因烟草的应用提供依据。论文主要研究内容和结果如下:*** IFNs转基因烟草的遗传稳定性。利用GUS组织化学染色、基因组PCR扩增以及ELISA实验,对T代Ch IFN-α、Ch IFN-γ和F代Ch IFN-α-γTP烟草进行鉴定。结果显示三种TP烟草具有良好的遗传稳定性,GUS报告基因表达阳性,目的基因翻译表达出的重组蛋白(r Ch IFN)在三种TP烟草中的含量分别是r Ch IFN-α为27.05 ng·L、r Ch IFN-γ为29.52 ng·L、r Ch IFN-α-γ为52.64 ng·L。2.转Ch IFNs基因烟草的生长发育表现。对移栽土壤25 d的TP5、TP4、TP2 TP烟草和野生型亲本(WT)的生长发育进行观察比较。发现三种TP烟草的株高分别比WT增加了5.18%、23.29%和44.71%(P0.05),叶长增加2.74%、2.56%和2.91%,TP2烟草的叶宽比WT增加1.14%。TP烟草发育较为健壮,具有较好的生长优势,Ch IFNs基因的表达促进了受体烟草的生长和发育。3.转基因烟草的TMV抗性分析。采用PBS溶液对-80℃保存的TMV病毒液进行稀释,通过机械摩擦法将病毒接种于7～8叶期烟草叶片进行增殖,利用ELISA对TMV病毒进行毒力鉴定和分析,发现接种24 h时叶片中TMV的OD值为0.390,接种病毒具有较强的活力。TP与WT烟草的TMV离体叶片接种实验发现,24 h时的TP5、TP4、TP2三种叶片中病毒含量均较WT型低,以TP5和TP2最为显著,分别低于WT叶片14.87%和14.36%(P0.05)。转Ch IFNs基因烟草对TMV具有良好的抗性。4.转Ch IFNs基因烟草的光合性能。移栽25 d的TP5、TP4和TP2 烟草叶片中,叶绿素含量分别比WT高0.33%、4.03%和4.58%;上述3种TP烟草和WT烟草的净光合速率分别为4.62 umol/(m·s)、4.91 umol/(m·s)、4.90 umol/(m·s)和5.08 umol/(m·s),气孔导度分别为0.13 umol/(m·s)、0.10 umol/(m·s)、0.10 umol/(m·s)和0.09 umol/(m·s),蒸腾速率分别为5.83 umol/(m·s)、5.68 umol/(m·s)、5.59 umol/(m·s)和5.64 umol/(m·s)。Ch IFN基因表达对受体烟草叶绿素和光合参数无明显影响。对7～8叶期TMV侵染离体叶片的叶绿素测定发现,TMV侵染12 h时TP2的叶绿素总量增加了7.115%;24 h时TP5α、TP4γ、TP2αγ和WT中的叶绿素a分别下降了5.361%、3.511%、5.952%和13.897%,TP5的叶绿素总量增加了4.546%,而WT叶绿素总量下降16.580%;36 h时,TP5、TP4、TP2和WT的叶绿素a含量均下降,以WT最为显著,为21.608%(P0.01)。TP叶片的叶绿素在TMV侵染后能有效维持,具有较好的光合同化基础。***侵染对烟草种子萌发和生长的影响。将TP5、TP4、TP2TP和WT烟草种子进行TMV病毒液浸泡萌发实验。TMV处理三种TP和WT种子的发芽率分别为44.67%、58.00%、60.00%和8.00%,发芽势分别为19.33%、28.67%、32.00%和0.67%。TMV处理对TP烟草种子的萌发影响小;与WT相比,三种TP烟草种子提前3 d露白,子叶形成提前5 d。三种TP烟草种子萌发和生长过程中表现出一定的TMV抗性。6.转Ch IFN-α基因烟草的生长发育和TMV抗性分子调节机制。构建TMV侵染0d、6d、9d的转Ch IFN-α基因和WT烟草叶片c DNA文库并进行转录组测序。数据分析发现病毒侵染中期和后期,TP和WT烟草中参与生长或抗病性调控的差异表达基因数目存在差异;GO和KEGG分析发现,TP和WT烟草中分别富集到12条和19条通路;从TMV侵染3个时期的烟草共表达差异基因中,挖掘出Nitab4.5＿0000152g0350.1、Nitab4.5＿0000397g0020.1、Nitab4.5＿0000527g0160.1、Nita