拟盘多毛孢果胶裂解酶PL1B基因作为SIGS靶标的研究

作     者：尹桥秀 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈卓

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：茶叶斑病 拟盘多毛孢 RNA干扰 遗传转化 病毒诱导基因沉默 喷施诱导基因沉默 

摘      要：茶叶斑病是一类常见的茶树病害,它严重影响茶叶产量和品质。分离鉴定茶叶斑病的病原、研究叶斑病的发生流行规律、筛选绿色高效的药剂、研究药剂作用机制,对于茶叶斑病的防治具有重要的意义。本论文从贵州省余庆县二龙茶区茶叶斑病中分离纯化多个菌株,其中代表性菌株GZYQ2018YQX001在PDA上的菌落形态,早期正面呈白色,反面从中央向外,逐渐变成淡黄色。随着培养时间的加长,气生菌丝变浓密,菌落背面呈黄色。到后期,有少量和较小的子实体产生,菌落反面呈深黄色。在孢子形态上,产孢细胞呈梭形,细胞壁较薄。分生孢子呈纺锤形、薄壁、具橫隔。成熟的分生孢子大小(23.56±2.89)μm(最小长度17.49μm～最大长度30.16μm)×(6.3±0.75)μm(最小宽度4.74μm～最大宽度7.4μm)。采用EF1-α、ITS和TUB 3个基因或核酸序列进行串联加合,其加合总长度为2027个位点,数据为EF1-α(1-995)、ITS(996-1545)、TUB(1546-2027)。使用PAUP V 4.0B10软件及最大简约法生成系统发育树。结果表明,代表菌株GZYQ2018YQX00l与Pestalotiopsis trachicarpicola MFLUCC12-0264在系统发育树上聚为一支,自举支持率为100%。通过致病性实验表明,菌株GZYQ2018YQX001为茶叶斑病的病原菌。采用扫描电镜对菌株GZYQ2018YQX001侵染茶叶不同时期的形态学观察发现,菌株GZYQ2018YQX001主要是通过气孔对茶叶进行侵染。对病原菌侵染茶叶后不同时期的叶片进行RNA提取、反转、文库构建,并通过Illumina Novaseq6000平台进行RNA的测序,通过GO和KEGG数据库对差异表达的基因进行功能分析,发现大量基因与果胶裂解酶相关。其中,PL1B差异表达最显著。PL1B与病原菌侵染密切相关,本研究利用遗传转化和病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术对***的基因功能进行鉴定。通过构建植物表达载体p Cambia2301-KY,把PL1B基因转入本氏烟草中,通过PCR,鉴定出了6株阳性植株。采用RT-q PCR检测6株阳性植株的PL1B基因表达情况,结果表明:2号植株的表达量最高,其次是1号植株。通过对6株阳性植株的表型进行观察发现,相比较于野生型植株,阳性植株呈现出矮小,分支多且叶片白化等症状。构建PL1B基因的TRV-VIGS瞬时表达载体,观察PL1B基因沉默烟草的表型,结果表明,沉默10 d后,表型变化不明显。q-PCR表明,PL1B-17-4B-2和PL1B-17-3B-3目的片段注射本氏烟草后,其表达量显著提高。分别对PL1B基因沉默植株及空载对照植株进行致病性分析,结果表明沉默目的基因的本氏烟草的病斑要小于空载对照的本氏烟草,CK处理没有症状。综上所述,PL1B基因有可能作为喷施诱导基因沉默(Spray-induced gene silencing,SIGS)靶标,且该研究结果也为培育基于病原菌特异序列的植物抗病遗传改良奠定了基础。