丁香酚对斑马鱼胚胎发育的影响及其作用机制研究

作     者：段必成 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李云

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：丁香酚 毒性 斑马鱼胚胎 鳔 转录组 

摘      要：丁香酚（Eugenol）作为植物源性的天然化合物,具有麻醉效果好、毒性小、价格低和残留少等诸多优点,作为新一代的渔用麻醉剂已经得到越来越多的关注和应用。丁香酚作为渔用麻醉剂的研究有不少报道,但大多是关于丁香酚对鱼类的麻醉效果,如麻醉浓度、时间等,而对于丁香酚对水环境的安全性研究很少,其使用不当或过度使用存在的水体污染和对水生生物的潜在风险仍然有待研究,因此,本论文针对丁香酚对鱼类胚胎发育的影响进行研究,旨在为丁香酚对鱼类繁育可能造成的潜在风险提供参考。本研究以模式实验生物斑马鱼（Danio rerio,AB型）胚胎为研究对象,用发育至24hpf的斑马鱼胚胎,在浓度梯度为0、10、15、20、25、30mg/L的丁香酚中进行96h的暴露实验,通过形态学观察、整胚转录组学和实时荧光定量PCR的方法来探讨丁香酚暴露对斑马鱼胚胎发育的影响及其作用机制。主要研究结果如下:形态学研究结果显示,10～30mg/L丁香酚暴露会造成斑马鱼胚胎孵化出现延迟,鳔发育缺失率明显升高,体长增长速度明显下降,在开口期（120hpf）前各浓度组死亡率与对照组相比均无显著差异,而开口期后鳔缺失的仔鱼因难以正常游动而摄食困难,最终逐渐死亡,各浓度组的累计死亡数与对照组相比明显升高;这些形态异常程度与丁香酚的浓度有一定的正相关性。用整胚RNA-seq转录组分析了对照组与丁香酚较低浓度（15mg/L）暴露组在孵化期（72hpf）和开口期（120hpf）两个时期的斑马鱼胚胎基因表达谱特征,研究结果显示,在孵化期丁香酚暴露组与对照组相比,有275个基因具有显著性差异,其中109个基因上调,166个基因下调;在开口期暴露组与对照组相比,有297个基因具有显著性差异,其中66个基因上调,231个基因下调;层次聚类树分析显示各组样品的生物学重复之间差异很小,而组间差异很大,这些结果表明丁香酚暴露对斑马鱼胚胎的发育在基因表达层面造成了明显影响。15mg/L暴露组与对照组相比在孵化期和开口期表达都有显著差异的基因有37个,这些差异基因的变化主要集中在药物分解代谢途径和抗氧化系统,其中调控药物代谢途径的基因有cyp1c2、cyp2r1、cox5b2、hbae5、zgc:101040,调控抗氧化系统的基因有cyp1c2、cyp2r1、cox5b2、dao.1、xdh、fads2、nfkbiaa、gadd45ba。此外,调控消化相关酶胰蛋白酶和锌羧肽酶活性的基因表达水平均出现显著下调,其中调控胰蛋白酶活性的基因有bfb、CELA1（1 of many）、prss1、prss59.1、prss59.2、ctrb1,调控锌羧肽酶活性的基因有cpa4、cpa5、cpb1。这些变化表明丁香酚暴露后仔鱼的组织器官可能受到了氧化损伤,正常摄食消化功能也可能受到了影响。实时荧光定量PCR对转录组学研究结果中的药物分解代谢途径和抗氧化系统部分相关基因（cyp1c2、cyp2r1、cox5b2、hbae5、dao.1、xdh）在孵化期和开口期的表达水平进行了验证,验证结果与转录组学结果一致。同时还检测了调控鱼鳔发育的Wnt-β-catenin信号通路中的部分关键基因（wif1、dkk1b、fzd3b、fzd6、ctnnb1、lef1）在孵化期和开口期的表达水平,结果发现这一通路的传导被抑制,其中Wnt信号通路抑制基因wif1表达显著上调,通路内基因fzd3b、fzd6、ctnnb1和lef1表达均显著下调,以上这些基因表达水平的变化情况与丁香酚浓度在10～30 mg/L时均存在一定的浓度依赖性。结果表明,丁香酚对斑马鱼胚胎发育存在毒性影响,可能造成了组织器官的氧化损伤,丁香酚可能通过下调Wnt-β-catenin信号通路基因抑制了鳔的正常发育。结果显示,丁香酚对斑马鱼胚胎存在剂量依赖的毒性效应。丁香酚暴露会引起斑马鱼胚胎发育延迟,组织氧化损伤,消化酶活性下降。丁香酚暴露所致的开口期鳔发育缺失可能由Wnt-β-catenin信号通路传导抑制所致,鳔缺失仔鱼最终会死亡。本研究结果可丰富对丁香酚胚胎毒理学的知识,为丁香酚环境毒理学提供参考数据。