全外显子组测序在非免疫性胎儿水肿病因检测中的研究

作     者：张田园 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孔祥东

授予年度：2021年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：全外显子组测序 胎儿水肿 非免疫性胎儿水肿 拷贝数变异测序 

摘      要：背景胎儿水肿(fetal hydrops,HF)是一种液体内环境紊乱的病理状态,它导致液体在胎儿间质间隙中异常积聚。HF的诊断依赖于超声检查,超声表现为至少2处胎儿体腔异常积液,包括胸腔积液、腹腔积液、心包积液及皮肤水肿。胎儿水肿主要包括两种类型:免疫性胎儿水肿和非免疫性胎儿水肿(non-immune hydrops fetalis,NIHF)。目前大多数胎儿水肿病例为NIHF,占胎儿水肿病例的85-90%。NIHF的妊娠期发病率为1/1700-3000,死亡率较高,根据病因的不同大概在55%和90%之间。了解NIHF的病因对于妊娠期和新生儿期的有效管理是非常重要的,因为发病率和死亡率都取决于内在的遗传学原因。目前,NIHF的一线检测方法包括核型和染色体微阵列(chromosomal microarray,CMA)、胎儿超声心动图、病毒聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)。然而,在经过推荐的标准检测评估后,仍然有多达一半的病例病因不明确,NIHF有许多可能的单基因病因,其中一些单基因病可进行早期干预治疗,但目前的诊断方法并不详尽。全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)技术,尤其是父母-胎儿三人全外显子测序分析(trio whole exome sequencing,trio WES)策略在变异检测方面具有独特的优势。本研究中,使用trio WES技术对3例连续发生NIHF的家系进行父母-胎儿三人全外显子测序分析,探讨在拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)结果为阴性时,联合trio WES在明确NIHF病因中的应用价值。目的研究在CNV-seq检测结果阴性时,利用WES检测3例连续发生非免疫性胎儿水肿家系的遗传学病因的价值。对象与方法1.对象本课题收集了因既往妊娠一次及一次以上非特异性胎儿水肿胎儿,本次妊娠胎儿仍诊断为非特异性胎儿水肿的3个家系。家系1孕妇妊娠年龄为23岁,孕周为30周,胎儿超声表现:全身皮肤增厚、水肿,胸腹腔积液,羊水增多,右足姿势异常-马蹄内翻足可能;家系2孕妇妊娠年龄为29岁,孕周为19周,胎儿超声表现:全身皮肤水肿,双侧胸腔大量积液,腹腔大量积液;家系3孕妇妊娠年龄为25岁,孕周为29周,胎儿超声表现:胎儿全身皮肤水肿增厚,胸腹腔积液,双肾皮质回声稍增强。所有夫妇均非近亲结婚,并且所有夫妇均无遗传性疾病家族史。2.方法分别采集家系1引产胎儿的皮肤组织以及夫妻双方外周血5ml,家系2和家系3孕妇的羊水及夫妻双方外周血5ml,用天根生化科技(北京)有限公司生产的试剂盒提取全基因组DNA,用Qubit 2.0荧光计(美国Thermo Fisher Scientific公司)对DNA的浓度进行定量。对3例家系进行CNV-seq检测,除家系1送检样本为引产胎儿组织,未进行CNV-seq检测,其余两例家系均进行了 CNV-seq检测,并对检测结果进行CMA验证。在明确CNV-seq结果为阴性后,对3例家系进行trio WES检测,应用Illumina的液相芯片捕获系统,对全外显子区域DNA进行富集,然后在Illumina Nova6000测序平台上进行高通量测序。再应用dbSNP数据库、1000dGenome数据库、SIFT和PolyPhen2软件等进行基因的筛选。对筛选所得变异基因位点,进行Sanger测序验证。结果1.家系2和家系3 CNV-seq检测结果为阴性;2.家系1 trio WES检测出胎儿SOX18基因c.976GT杂合变异,RYR1基因c.844CT和c.9472+1GA复合杂合变异,这三个变异遗传自胎儿父母;3.家系 2 trio WES 检测出胎儿PIEZO1基因 c.6682CT 和 c.4373383del 复合杂合变异,这两个变异遗传自胎儿父母,结合家系分析提示胎儿为淋巴畸形6型患者;4.家系3 trio WES检测出胎儿TTN基因c.29860GC和c.21107AT复合杂合变异,这两个变异遗传自胎儿父母;结论1.本研究利用trio WES在3例连续发生NIHF的家系中检测到3个明确致病基因,RYR1,PIEZO1和TTN;2.在CNV-seq检测结果为阴性时,trio WES可提高NIHF病因的检出率;*** WES数据分析结合家系分析和胎儿临床表现可提高变异解读的准确性。