具有Ⅲ型分泌系统的植物益生荧光类假单胞菌的筛选、评价与基因组分析

作     者：廖开吉 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾凯芳

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：荧光类假单胞菌 Ⅲ型分泌系统 益生功能 基因组分析 

摘      要：果蔬采后病害的化学防治是影响食品安全的主要隐患,开发基于有益微生物资源的生物防控是实现绿色食品生产的重要途径。荧光类假单胞菌是一类与植物关系密切的有益微生物菌群,可产生多种次生代谢物质,具有抑菌促生、控制采后病害的功能。最新研究发现,某些荧光类假单胞菌具有与植物病原细菌同源的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)合成基因,但其分布、结构特征仍是未知之谜。本研究广泛采集作物根际土壤,分离和筛选具有T3SS的荧光类假单胞菌,检测和评估这类细菌的益生和防病活性,并通过基因组测序和分析揭示T3SS的结构和细菌遗传特性。研究结果概括如下:(1)从我国19个省市采集了61份不同作物根际土壤样品,共分离到1611株荧光类假单胞菌。通过检测发现494株菌对青枯菌、8株菌对丁香假单胞菌、776株菌对稻瘟菌以及803株菌对大豆疫霉具有拮抗活性。同时,基于T3SS保守的hrcC基因,设计了筛选引物hrcC3,从1611株荧光类假单胞菌中筛选到67株具有hrcC基因片段的菌株,检出率为4.2%,其中15个株细菌具有完全不同的hrcC基因序列。(2)15株具有不同T3SS的荧光类假单胞菌对指状青霉和意大利青霉均有不同程度的抑制作用。其中FP2301的抑制效果最为明显,对两种病原菌离体抑制率均达到了100.0%,果实的发病率分别降低了50.0%和45.3%。15株菌的益生功能检测如下:12株菌能够产生蛋白水解酶;15株菌能够产生嗜铁素、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶以及吲哚乙酸等物质,同时具备形成生物膜的能力;15株菌均不能产生淀粉酶、纤维素酶;FP1749和FP1962注射本氏烟草叶片,能够引起过敏性坏死反应。(3)15株荧光类假单胞菌基因组测序与分析表明,平均基因组长度为6.40Mbp,GC含量为60.3%,产生5763个编码序列。多基因序列进化分析(Multilocus Sequence Analysis,MLSA)和平均核苷酸均一性分析(Average Nucleotide Identity,ANI)结果表明,该15株荧光类假单胞菌可以分成4个亚组,分别为为:*** FP834、FP1501、FP2054、FP690、FP2087以及FP1885;*** FP1743、FP1749以及FP1962;*** FP822、FP1162、FP2301、FP425、FP2262;*** FP1761。15株荧光类假单胞菌的泛基因组包含13265个编码基因,其中核心基因3062个,占平均基因组大小的53.1%。通过构建hrcC基因系统发育树可以将15株不同的T3SS分为了7类型,且用BlastP扫描显示各菌株均具有效应蛋白同源物。利用antiSMASH对基因组代谢产物合成基因簇分析,发现这些菌株可以合成丰富的代谢产物如聚酮化合物、环状脂肽细菌素、嗜铁素。在FP2301发现了2,4-二乙酰基间苯三酚合成基因簇,为病原菌拮抗提供了直接证据。