抗HUVEC细胞高糖损伤活性物质的筛选及其机制的研究

作     者：冯彤彤 

作者单位：西南交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：喻凯

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：尖萼金丝桃 匙萼金丝桃 蜂王浆 抗高糖损伤 筛选 氧化 炎症 凋亡 

摘      要：持久性的高糖环境对血管内皮细胞的损害是糖尿病并发症的重要机制之一。缓解高糖环境对血管内皮细胞的损伤可以有效防治糖尿病主要并发症。本研究体外建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高糖损伤模型,试图从匙萼金丝桃(Hypericum uralum Buch.-*** ***)和尖萼金丝桃(Hypericum acmosepalum ***)提取物、蜂王浆(Royal jelly,RJ)组分中筛选出抗高糖损伤的活性组分,并进一步对部分活性组分进行抗高糖损伤的机制探究,为进一步研发抗血管内皮细胞损伤的新药奠定一定实验基础。1.高糖损伤筛选模型及阳性对照的建立本实验采用CCK-8法,探究了不同浓度、不同时间的高浓度葡萄糖对HUVEC细胞的抑制作用。探究了两个时间点(24、48 h),比较了五个浓度(22、33、44、55、66 mmol/L)的葡萄糖对HUVEC细胞的抑制作用。结果显示,当葡萄糖浓度为44 mmol/L,孵育时间为48 h时,对HUVEC细胞的抑制率是56%左右,抑制作用较强,故模型组选用葡萄糖浓度为44 mmol/L,孵育时间为48 h。还探究了阿司匹林作为阳性对照的最适浓度,比较了0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 mmol/L的阿司匹林修复作用。依据实验结果,将阳性对照的浓度定为0.1 mmol/L的阿司匹林。2.抗HUVEC细胞高糖损伤活性物质的筛选及活性组分EC的确定本实验将利用前期确定的高糖诱导的细胞氧化应激衰老模型以及阿司匹林阳性对照,对匙萼金丝桃(21种组分)、尖萼金丝桃(24种组分)以及蜂王浆(脂溶蛋白、水溶蛋白)共47个组分,进行抗HUVEC细胞高糖损伤活性物质的筛选,筛选浓度为50μg/m L。对于活性好的组分,再分6个浓度梯度(10、20、40、60、80、100μg/m L)进行筛选,并求出半数有效浓度(EC)。结果显示,匙萼金丝桃(Hu系列)2、4、20、55、71、72、78、79、81、82、85、87、93、94、95、97号样品,尖萼金丝桃(Ha系列)10、12、16、17、19、20、21、22、23、27、31、32、33、34、35、36、39号样品以及蜂王浆脂溶蛋白、水溶蛋白,细胞活力明显高于模型组,说明其对高糖损伤的HUVEC细胞有修复作用;Hu55、Hu72、Hu78、Hu81、Hu82、Hu87、Hu93、Hu94、Hu95、Hu97、Ha10、Ha16、Ha17、Ha20、Ha21、Ha23、Ha24、Ha26、Ha31、Ha35、Ha36、Ha39的EC分别是51.622、17.108、35.841、8.549、28.229、12.86、15.958、29.033、5.731、15.717、7.671、36.771、4.144、31.634、22.752、8.541、22.23、10.499、34.097、13.406、27.876、10.446μg/m L。3.四种活性组分抗HUVEC细胞高糖损伤的相关机制探究本部分研究了来自金丝桃属植物,活性最高的Hu95、Ha17以及RJ脂溶蛋白、RJ水溶蛋白四种活性组分的部分作用机制。利用前期建立的损伤模型,再分别加入不同浓度的各活性组分作用于模型细胞,CCK-8法检测活性组分对模型细胞增殖的影响;β-半乳糖苷酶法检测活性样品对模型细胞衰老的影响;酶联免疫吸附法检测活性组分对模型细胞炎症因子TNF-α和IL-4分泌的影响;流式细胞术检测活性组分对模型细胞ROS的分泌的影响;Hoechst33342/PI双染法检测四种活性组分对模型细胞凋亡及坏死的影响;检测四种活性组分对模型细胞SOD分泌的影响。结果显示,一定浓度下的活性组分可以促进模型细胞的增殖、降低β-半乳糖苷酶的染色阳性率、增加SOD的酶活、减少ROS、炎症因子TNF-α和IL-4的分泌、减少细胞凋亡。这表明活性组分的抗高糖损伤的作用可能与增强抗氧化酶-SOD酶活、提高模型细胞清除ROS的能力、影响炎症反应、减少细胞凋亡有关。